sds法提取dna

1、DNA抽提緩沖液（lysisbuffer）：50mMTrisHcl（Ph7.2）50mMEDTA3%SDS1%β巰基乙醇（用時加）飽和酚：氯仿（V：V1：1）異丙醇3M醋酸鈉NaOAc（Ph8.0）1稱取0.075－0.085g干菌絲置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至細(xì)粉末狀，迅速轉(zhuǎn)至1.5ml的離心管中并加入750μlDNA提取緩沖液（65℃預(yù)熱），在振蕩器上振蕩幾秒鐘充分混勻，然后放到65℃水浴鍋中水浴60min，每10min搖動一次

2、。2加入750μl飽和酚：氯仿（V：V1：1）輕輕顛倒離心管數(shù)次充分混勻，室溫下12000rpm離心15min，取上清液置于新的離心管中。3加入130體積的3M醋酸鈉NaOAc（PH8.0）和0.54體積的異丙醇，輕輕混勻后置于4℃冰箱中30min，室溫下12000rpm離心2min，小心倒掉上清液，然后用冷的70％乙醇洗滌沉淀兩次（輕輕顛倒離心管若干次），倒掉乙醇。4將裝有DNA沉淀的離心管置于真空干燥器中，干燥約30min（時間以D

3、NA變干為準(zhǔn)）。5加入500μl的ddH2O溶解DNA沉淀，同時加入1－2μlRNase（終濃度為20μgml）37水浴60min。6加入等體積的飽和酚：氯仿（V：V1：1），充分混勻，然后室溫下12000rpm離心15min，取上清液置于新的離心管中。7重復(fù)步驟3。8重復(fù)步驟4。9加入100mlTE溶解DNA，待完全溶解后置于－20℃冰箱中備用。關(guān)于基因組酶切：每次切100ul體系，79ulDNA，（濃度200微克以上），單酶切的話酶

4、7微升，buffer14ul，酶切5小時或者過夜都可以。。。。Q1：Southern雜交的基本原理是什么？應(yīng)用范圍？原理：其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的?；蚪MDNA首先用一種或幾種限制性內(nèi)切核酸酶消化，消化后的片段通過標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖電泳按照大小進(jìn)行分離。然后DNA經(jīng)過原位雜交，從膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上（通常是尼龍膜或硝酸纖維素膜）。附著于膜上的DNA可以與標(biāo)記的

5、DNA、RNA或者寡核苷酸探針雜交，通過特定的檢測方法如放射自顯影可以確定與探針互補的帶的位置。通過對經(jīng)過不同限制性內(nèi)切核酸酶（單一的或聯(lián)合使用的）消化過的基因組DNA、產(chǎn)生的條帶的大小以及數(shù)量的估計，可以判斷靶基因上下游限制性內(nèi)切核酸酶的位置。應(yīng)用范圍：利用Southern印跡法可進(jìn)行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩

6、沖液，以一定的遷移率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。DNA分子的遷移速度與其分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。當(dāng)用EB對DNA樣品染色時，加入的EB就插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物，熒光的強度與DNA含量成正比，如果用DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)品作電泳對照，就可以估計出待測樣品的分子量大小和濃度。Q7：TAE與TBE緩沖液系統(tǒng)有什么差異？應(yīng)用的異同點？TAE是Tri

7、s乙酸，緩沖容量小，但是溶解度大，易于儲存TBE是Tris硼酸，緩沖容量大，但是溶解度小，不易長期儲存，易產(chǎn)生沉淀。TAE與TBE緩沖溶液的成份如下：50xTAEBuffer(TrisAcetateEDTA)242gTrisbase57.1mlAceticacid100ml0.5MEDTAAddddH2Oto1literadjustpHto8.5.10xTBEBuffer(TrisBateEDTA)108gTrisbase55gBica

8、cid9.3gNa4EDTAAddddH2Oto1liter.ThepHis8.3requiresnoadjustment.TAE是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。其特點是超螺旋在其中電泳時更符合實際相對分子質(zhì)量（TBE中電泳時測出的相對分子質(zhì)量會大于實際分子質(zhì)量），且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較TBE緩沖液快，電泳大于13kb的片段時用TAE緩沖液將取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時也易用TAE緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳。TAE的缺點是緩沖容量

9、小，長時間電泳（如過夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。TBE的特點是緩沖能力強，長時間電泳時可選用TBE，并且當(dāng)用于電泳小于1kb的片段時分離效果更好。TBE用于瓊脂糖凝膠時易造成高電滲作用，并且因與瓊脂糖相互作用生成非共價結(jié)合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收電泳中使用。Q8：簡述虹吸法轉(zhuǎn)膜的基本原理與物理學(xué)過程。利用毛細(xì)管的虹吸作用由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動核酸分子轉(zhuǎn)移至濾膜上。DNA片段由液體攜

10、帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并聚集于薄膜表面。液體通過毛細(xì)管作用抽吸通過凝膠，借助于一疊干的吸水紙巾產(chǎn)生并維持毛細(xì)管作用。轉(zhuǎn)移的速度取決于DNA片段的大小和凝膠中瓊脂糖的濃度，小片段DNA（1kb）1h內(nèi)就能夠從0.7%瓊脂糖上幾乎定量地轉(zhuǎn)移，而較大片段的DNA轉(zhuǎn)移較慢且效率較低。Q9：概述DNA變性與復(fù)性的過程。為什么在轉(zhuǎn)膜前要進(jìn)行變性與復(fù)性？1.變性加熱、低鹽及強酸、強堿均可使DNA變性。①DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級鍵，能量較低，易