sod提取純化

1、1動(dòng)物血中超氧化物歧化酶的提取與純化動(dòng)物血中超氧化物歧化酶的提取與純化一、超氧化物歧化酶的提取超氧化物歧化酶的提取[原理原理]l969年，McCd和Fridovich第一次從牛血中提純到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布極廣，其含量隨生物體的不同而不同，即使同一種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD的種類和含量也有很大差別。迄今為止人們已從細(xì)菌，真菌、原生動(dòng)物。藻類、昆蟲、魚類、植物和動(dòng)物等各種生物體內(nèi)分離得到SOD。為拓寬提取

2、SOD的原料，篩選或基因過程開發(fā)產(chǎn)SOD量較高的菌株。目前，研究開發(fā)最多的資源還是從動(dòng)物血液、動(dòng)物組織中制備提純SOD。從動(dòng)物血液材料中制備CuZnSOD純化工藝分為三個(gè)主要步驟：（1）原材料的預(yù)處理；（2）粗酶液的制備；（3）離子交換柱層析精制。國(guó)內(nèi)多采用Mccd和Fridovich法，其主要工藝過程為：第一步，乙醇氯仿除去血紅蛋白；第二步，有機(jī)溶劑和硫酸銨分級(jí)沉淀；第三步，離子交換柱層析精制。[試劑和器材試劑和器材]1、試劑3.8%

3、（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）檸檬酸三鈉；0.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉；95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇；氯仿；丙酮；pH7.6、2.5mmolLK2HPO4KH2PO4緩沖液；DEAESephadexA502、器材豬血；恒溫水??；離心機(jī)；布氏漏斗；抽濾瓶；燒杯、量筒、攪棒等；透析袋[方法和步驟方法和步驟]1、從豬血中提取SOD（1）分離血球取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1，輕輕攪拌均勻，4000rmin離心20min，收

4、集紅血球。（2）除血紅蛋白紅血球用3倍體積生理鹽水洗滌，4000rmin離心20min，重復(fù)三次，然后向洗凈的紅血球加入1～1.1倍體積去離子水，攪拌溶血30min，再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷95%乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h，然后4000rmin離心20min除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過濾，收集濾液（記3鹽酸把pH調(diào)至7.6，滴定可在pH計(jì)上進(jìn)行，須使懸液最終pH在10min內(nèi)

5、無變化，然后抽濾。（6）將上述濾塊置于100毫升量筒中，加入75mL緩沖液I，慢慢攪混之后，靜置20min，用傾斜法除去上清液中細(xì)微粒子，如此重復(fù)若干次，最后上清液pH與緩沖液I幾乎一致。2、裝柱（1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯(lián)接塑料管，裝上螺旋夾。關(guān)上螺旋夾，柱內(nèi)裝入緩沖液I，微開螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區(qū)及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關(guān)閉螺旋夾。（2）將基本平衡好的DEAE纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放

6、在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時(shí)，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時(shí)的流速要比正常洗脫時(shí)的流速慢，陸續(xù)加入較多的漿液，直至達(dá)到高10cm以上的柱床體積。3、平衡當(dāng)全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩沖液進(jìn)行平衡。流速可維持在4mL15min，直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過夜。）4、層析用毛細(xì)吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開出口使緩沖液Ⅰ恰流到表面，關(guān)閉出口

7、。用毛細(xì)吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入SOD粗酶液，打開出口，使樣品溶液進(jìn)入纖維素內(nèi)，至幾乎露出床面時(shí)，柱壁用少量緩沖液小心洗滌2～3次，然后裝入緩沖液Ⅰ，使液面高出創(chuàng)面2～3cm左右。5、洗脫（1）按圖將梯度洗脫器和層析柱連接好。（2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶B（混合器）內(nèi)各裝入100mL緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ，注意兩洗脫瓶，特別是液面應(yīng)處于同一水平面，同時(shí)應(yīng)排除連接管內(nèi)氣泡。（3）開動(dòng)電磁攪拌器開關(guān)，調(diào)節(jié)攪拌速度，以混合器內(nèi)緩沖液旋轉(zhuǎn)