蛋白濃度測定(完成)

1、蛋白濃度測定蛋白濃度測定蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)。在生化實驗中，對樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來了許多具體的困難。目前測定蛋白質(zhì)含量

2、的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：物理性質(zhì)：紫外分光光度法化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法其他性質(zhì)：熒光法蛋白質(zhì)測定的方法很多，但每種方法都有其特點和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測試則不太合格；雙縮脲法操作簡單，線性關(guān)系好，但靈敏

3、度差，樣品需要量大，測量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補了它的缺點，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡便開始重新受到關(guān)注；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測定。常用的測定蛋白質(zhì)含量方法的比較方法測定范圍（μgml）不同種類蛋白的差異最大吸收波長(nm)特點凱氏定氮法小標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確，操

4、作麻煩，費時，靈敏度低，適用于標(biāo)準(zhǔn)的測定紫外分光光度法100—1000大280205靈敏，快速，不消耗樣品，核酸類物質(zhì)有影響雙縮脲法1000—10000小540重復(fù)性、線性關(guān)系好，靈敏度低，測定范圍窄，樣品需要量大Folin酚試劑法20—500大750靈敏，費時較長，干擾物質(zhì)多考馬氏亮藍(lán)G25050—500大595靈敏度高，穩(wěn)定，誤差較大，顏色會轉(zhuǎn)移BCA50—500大562靈敏度高，穩(wěn)定，干擾因素少，費時較長由于凱氏定氮法的操作作過于

5、復(fù)雜，雙縮脲法的靈敏度又太低，下面介紹Folin—酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)G—250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。20ul體系蛋白濃度mgml加入C液量ul補足PBS量ul00200.050.219.80.10.419.60.20.819.20.31.218.80.41.618.40.52180.62.417.60.72.817.20.83.216.80.93.616.414161.561428122.510103

6、1283.514641645200注意事項注意事項1.在低溫條件或長期保存出現(xiàn)沉淀時，可攪拌或37℃溫育使溶解如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染則應(yīng)丟棄。2.樣品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸銨、脂類會影響檢測結(jié)果，請試用Bradfd蛋白濃度測定試劑盒；高濃度的去垢劑也影響實驗結(jié)果，可用TCA沉淀去除干擾物質(zhì)。3要得到更為精確的蛋白濃度結(jié)果，每個蛋白梯度和樣品均需做復(fù)孔每次均應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。4當(dāng)試劑A和B混合時可能會有渾濁，但混勻后就會消失，工作液