結核分枝桿菌基因組學

1、結核分枝桿菌基因組學,黃 海 榮,國家結核病參比實驗室,提 綱一、結核分枝桿菌基因組總論二、目前一些相關實驗室技術的遺傳學背景 1 基因分型技術 2 耐藥的分子生物學診斷 3 新近的新疫苗、免疫診斷技術\,Maps of other spp.nearly identical,MoreThan 4,000 genes,Genome of M. tuberculosis,Cole et al. (1998

2、) Nature 393: 537-544,,The Structure of DNA,,,Figure 1. Schematic diagram of sequencing strategy used by the publicly funded Human Genome Project. The DNA was cut into 150 Mb fragments and arranged into overlapping cont

3、iguous fragments. These contigs were cut into smaller pieces and sequenced completely.,Figure 2. Schematic diagram of sequencing strategy used by Celera. The DNA was cut into small pieces and sequenced completely. These

4、fragments were organized into contigs based on overlapping sequences.,結核分枝桿菌的基本特征,H37Rv的全基因組由4　411　529個堿基組成，大約包括4000個基因，G＋C含量高達65.6%，表明結核分枝桿菌蛋白質在氨基酸組成上存在偏向性。H37Rv基因組中基因分布密度是平均1.1Kb長度有一個基因，這一數(shù)值與大多數(shù)原核生物的基因密度接近。與其他快生長的細菌如枯草

5、桿菌不同的是：H37Rv基因方向沒有明顯的偏向性，59%的基因轉錄方向與復制叉移動方向相同，而這一數(shù)值在枯草桿菌為75%。,在H37Rv基因組中已發(fā)現(xiàn)約4000個開放閱讀框，約占細菌編碼能力的91％。通過數(shù)據(jù)比較，現(xiàn)已確定了約40%的結核桿菌蛋白的功能；另有44%的蛋白與其他蛋白有相似性或可以獲得其功能相關信息；剩余的16%的蛋白與其他已知蛋白沒有相似性，可能是分枝桿菌特有的功能蛋白。,為什么要研究基因功能?更好的了解疾病的發(fā)病機制

6、開發(fā)新型的更為有效的治療措施開發(fā)或改良疫苗,How to find function?,Conserved Asp and Glu residues,1. Multiple sequence alignment,,,,,,,2. “Unknowns”,,Rv2874 (DsbD) – EM domain,Rv1347c – acyltransferase,Pa2754 = Rv1720c,Pa2307 = Rv3735,Pa12

7、18 = Rv0820,Rv2238c – AhpE,What is an operon?An operon is a set of genes that are:located on the same DNA strand coded in the same direction adjacent to one another transcribed/expressed togetherWhy predict opero

8、ns? Knowing the operons of a genome helps researchers better understand its organization. If researchers know how one of the genes in the operon functions, they can be confident that the other genes in the operon f

9、unction in a similar manner. A better understanding of the M. tuberculosis genome will lead to better treatment.,M. tuberculosis genome sequence,常用的基因分型技術的遺傳學背景,RFLPSpolgotypingMIRU-VNTR,基因組中的重要的結構序列-- 重復序列,結核桿菌基因組中存在重

10、要的重復序列:插入序列(insertion　sequence, IS)，以及分枝桿菌分散重復序列(mycobacterial　interspersed　repetitive　unit,MIRU),直接重復序列(Direct repeat,DR)。,IS6110 RFLP DNA fingerprinting,IS6110屬于IS3家族。IS6110是結核桿菌基因組中最常見的IS序列，也是目前研究比較清楚的 IS序列。在不同株細菌中，IS

11、6110的拷貝數(shù)變化很大，從0個到超過25個，這種差別是利用IS6110進行菌型鑒定的基礎。,根據(jù)結核分枝桿菌基因組中存在插入序列IS6110的數(shù)目和位置不同，利用限制性內切酶切割IS6110上相應位點并電泳分離，可以得到類似指紋（Fingerprinting）樣的特征性條帶，這些條帶被稱為IS6110 RFLP DNA指紋，該項技術為研究結核分枝桿菌基因分型奠定了基礎。,Chromosome of Mycobacterium tube

12、rculosis Hypothetical Strain X and Genotyping of M. bovis Bacille Calmette–Guérin (BCG), the M. tuberculosis Laboratory Strain H37Rv, and Strain X on the Basis of IS6110 Insertion Sequences and Mycobacterial Intersp

13、ersed Repetitive Units (MIRUs).,Mycobacterium tuberculosis IS6110 RFLP DNA Fingerprinting,Spoligotyping,,Spoligotyping的方法是根據(jù)在結核分枝桿菌中存在直接重復區(qū)域（Direct Repeat DR區(qū)），DR區(qū)間的寡核苷酸序列呈多態(tài)性而構建的。,具體方法為：采用PCR的方法擴增結核分枝桿菌基因組DNA DR間隔區(qū)，引物為D

14、Ra: 5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’, DRb: 5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’。且DRa 5‘末端標記有生物素。PCR產(chǎn)物與已知固定在膜上的43個DR間隔區(qū)進行雜交，通過增強化學發(fā)光試劑盒進行檢測。,Spoligotyping,The DR locus polymorphism: (van Embden et al.),M. canettii,M. microti,M. bovis,M. tub.

15、,,,,IS1096,,40,47,?,Beijing,The DR locus consists in a series of motifs (a repeat and a unique sequence) It changes by deletion of repeats and by insertion of IS elementsParticular patterns constitute signatures for ge

16、netic groups,,Mycobacterium tuberculosis Spoligotyping Genotype,Variable number tandem repeat (VNTR),分散的重復單位(MIRU)是位于基因間的一種特殊的分散重復序列，根據(jù)序列、組成和長度在46到101bp這些情況可將MIRU分為3種。結核桿菌H37Rv基因組中有65個拷貝的MIRU，分布于41個位點，主要位于操縱子的基因之間。MIRU可

17、以以連續(xù)重復的形式在不同種細菌中存在不同的拷貝數(shù)，由此被用來進行菌型鑒定。,,每個特定的VNTR位點由兩部分組成，即中間的核心區(qū)和外圍的側翼區(qū)。核心區(qū)含有至少一個以上稱為重復單元的短序列，一般該重復單元的堿基對數(shù)目不變，而串聯(lián)在一起的重復單元的數(shù)目是可變的。,,Chromosome of Mycobacterium tuberculosis Hypothetical Strain X and Genotyping of M. bovis

18、 Bacille Calmette–Guérin (BCG), the M. tuberculosis Laboratory Strain H37Rv, and Strain X on the Basis of IS6110 Insertion Sequences and Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs).,Jinghua2_1(ETRA),10005

19、00200100,ETRA_75bp_397bp_3U,1000500400200100,,3 U,,2 U,,3 U,,3 U,,4 U,,5 U,新型疫苗、免疫學診斷ESAT-6 CFP-10新型疫苗ELISPOTT-SPOT,差異區(qū)域（Regions of difference，RDs）/缺失區(qū)域（deleted　regions）,與分枝桿菌的抗原變異有密切關系。RD1是惟一的在BCG不

20、同類型的菌株和田鼠分枝桿菌中都發(fā)生缺失，而在致病性的結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中都存在的缺失區(qū)域,它是目前發(fā)現(xiàn)的惟一的具有上述特點的 DNA片段。,,,實線代表基因未發(fā)生缺失，虛線代表基因發(fā)生了缺失。RD1兩側的虛線代表基因未列出。由上至下列出的細菌分別為結核分枝桿菌H37Rv，牛分枝桿菌BCG，田鼠分枝桿菌OV254，結核分枝桿菌Tb56和牛分枝桿菌AF2122/97。,幾種分枝桿菌中RD1的缺失情況,RD1長9.455bp，雖然目前已

21、有較多的關于RD1的報道，但對于這一序列的真實功能還屬未知，甚至對于這一段序列包含多少個基因也還未有定論。一般認為，RD1可能共包括11個基因，即從Rv3866到Rv3879c間的基因片段，包括Rv3867、Rv3868、Rv3869、Rv3870、Rv3871、PE35、PPE68、esxB、esxA、Rv3876、Rv3877，其中esxB（Rv3874）和esxA（ Rv3875）編碼的兩個蛋白CFP-10和ESAT6目前正倍受關

22、注。,CFP-10（Culture filtrate protein）又稱結核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白，而Esat6（Early secreted antigen target）又叫早期分泌抗原，這兩種蛋白是細菌早期分泌的強T細胞抗原，近來已被應用作結核病早期診斷的指標。esxB和esxA兩個基因存在于同一操縱子內，被共同轉錄，它們的產(chǎn)物被共同分泌，最終以1:1的比例共同起作用。在RD1區(qū)與這兩個編碼基因相鄰的其他基因，業(yè)已被證明組成了一個分泌

23、系統(tǒng)。,,Growth in C57BL6 mice,TBTB△RD1BCG,Current thoughts on H37Rv?RD1,Attenuation mutant re-createdMutant makes less antigens, yet growth impaired The bacteria that makes more antigenic proteins grows better in the h

24、ost!,,,耐藥的分子生物學檢測方法,HAIN Test Gene Chips/Microarray,結核分枝桿菌耐藥相關基因1 異煙肼:katG基因、inhA、ahpc基因、oxyR基因2 利福平：rpoB基因3鏈霉素： rpsL基因、 rrs基因4吡嗪酰胺：pncA5乙胺丁醇： embCAB操縱子6喹諾酮類：GyrA和GyrB,其他抗結核藥耐藥相關基

25、因 卡那霉素和卷曲霉素的作用機制類似于鏈霉素，都是通過作用于16SrRNA改變核糖體結構，抑制蛋白合成。在rrs基因1400位堿基突變與高水平的卡那霉素耐藥有關?？敲顾睾途砬顾鼗蜃厦顾刂g存在交叉耐藥。環(huán)絲氨酸的殺菌機制是通過抑制D－丙氨酸消旋酶和D－丙氨酸：丙氨酸合成酶的活性抑制肽糖苷的合成。D－丙氨酸消旋酶的編碼基因是alrA，恥垢分枝桿菌的alrA已被克隆。當在恥垢分枝桿菌和BCG中用多拷貝載體表達alrA時會產(chǎn)生環(huán)絲

26、氨酸耐藥。研究已發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌中alrA啟動子突變會引起環(huán)絲氨酸耐藥。乙硫異煙胺在結構上與INH類似，可能其作用靶位也是分枝菌酸合成。InhA突變可以導致乙硫異煙胺與INH交叉耐藥，但肯定還有其他基因參與乙硫異煙胺耐藥的發(fā)生，過氧化物—過氧化氫酶的突變在乙硫異煙胺耐藥中并不起作用。,（1）靈敏度：研究試劑檢出陽性的樣本占對比試劑檢出陽性樣本總數(shù)的比例。（2）特異度：研究試劑檢出陰性的樣本占對比試劑檢出陰性樣本總數(shù)的比例。（3

27、）陽性預期值（PPV）：研究試劑檢出為真陽性結果的樣本占總檢出陽性樣本的比例。（4）陰性預期值（NPV）：研究試劑檢出為真陰性結果的樣本占總檢出陰性樣本的比例。,判斷一種診斷方法優(yōu)劣的幾項常用指標,,Genome Proteome Transcriptome

28、 Vaccinome Immunome,,后基因組時代,結 語 結核桿菌全基因組序列的闡明及其詳細的生物信息學分析，為人類提供了大量的信息，對于闡明結核分枝桿菌的獨特的生物學特點非常有價值?；蚪M學的研究成果必將深化人類對結核病新型治療和預防措施的研究。,謝 謝 ！,自然突變在不同的藥物發(fā)生率不同:異煙肼（isoniazid，INH）

29、為3.6×10-6、利福平 （rifampicin，RFP）為3.5 × 10-8、鏈霉素（streptomycin，SM）為3.8 × 10-6、乙胺丁醇 （Ethambutol，EMB）為0.5 × 10-4。在治療過程中如單一用藥，病變內絕大多數(shù)敏感菌群被殺死 ，而少數(shù)自然耐藥株得以繼續(xù)生長繁殖而成為優(yōu)勢菌群，從而產(chǎn)生了耐藥結核病，這就是當前普遍接受的選擇性突變學說。耐藥結核病中繼發(fā)耐藥占大

30、多數(shù),不合理化療方案、不規(guī)則用藥對病灶內的菌群進行了藥物選擇，清除了敏感菌，使耐藥菌成為優(yōu)勢菌。隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展，人們已從分子水平對結核桿菌的耐藥機制進行了研究，業(yè)已確定，結核桿菌對抗結核藥物的耐藥性主要是染色體突變所引起。,IS序列在分枝桿菌中普遍存在，3.4%的H37Rv基因組由插入序列和原噬菌體組成。在結核桿菌H37Rv基因組中已發(fā)現(xiàn)了56種完整的或有序列缺失的IS序列，分屬于至少9個不同家族；另外還發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的整合