血清膽固醇的定量測定

1、實驗二 血清膽固醇的定量測定（磷硫鐵法）,,,,,一、實驗?zāi)康?1、學(xué)習(xí)并掌握磷硫鐵法測定血清中總膽固醇含量的原理及操作；2、學(xué)會制備無蛋白血清 ；3、了解血清總膽固醇的正常值范圍及臨床意義 。,二、實驗原理,膽固醇的分子結(jié)構(gòu),3,17,1,膽固醇主要存在于動物細(xì)胞，參與膜的組成，質(zhì)膜中的含量比細(xì)胞器膜中的多。膽固醇也是血中脂蛋白復(fù)合體的成分；并與粥樣硬化有關(guān)，它是動脈壁上形成的粥樣硬化斑塊成分之一。膽固醇也是類固醇激素和膽汁酸

2、的前提。 1784年，從膽石中提取出膽固醇。,總膽固醇的測定方法： 磷硫鐵法 化學(xué)比色法 醋酸酐法 鄰苯二甲醛法 酶學(xué)方法（試劑盒）,,,用無水乙醇提取血清中的膽固醇，再與磷硫鐵試劑作用，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，呈色度與膽固醇含量成正比，可用比色法測定血清中膽固醇含量。,血清

3、經(jīng)無水乙醇處理后蛋白質(zhì)被沉淀，膽固醇及其脂則溶解在無水乙醇中。在乙醇提取液中加入硫磷鐵試劑（即濃硫酸和三價鐵溶液），膽固醇及其脂與試劑反應(yīng)形成比較穩(wěn)定的紫紅色化合物，呈色程度與膽固醇含量成正比，可于560nm 波長下進(jìn)行比色測定。,正常血清中膽固醇的含量有隨年齡增大而增加的趨勢，其平均正常值在110～220mg/100mL。 膽固醇含量在400mg/100ml內(nèi)，與A值成良好線性關(guān)系。,三、實驗器材,1、人血清2、

4、可見分光光度計3、臺式離心機(jī)（4000r/min）4、離心管5、試管6、移液管。,四、實驗試劑,1、10%三氯化鐵溶液：10.0g FeCl3·6H2O 溶于濃磷酸中，定容至100ml；2、磷硫鐵試劑(P-S-Fe 試劑)：取10%三氯化鐵溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶內(nèi)，加濃硫酸至刻度；3、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)貯液：準(zhǔn)確稱量膽固醇80mg，溶于無水乙醇，定容至100ml；4、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：將貯液用無水乙醇準(zhǔn)確稀釋

5、10倍即得，此標(biāo)準(zhǔn)液含0.08mg/mL膽固醇。5、無水乙醇,五、操作,1、膽固醇的提取 吸取血清0.1ml置干燥離心管內(nèi)，先加無水乙醇0.4ml，搖勻后再加無水乙醇2.0ml，搖勻，10min后離心（3000r/min-6000r/min）5min，取上清夜備用。,2、比色測定 取干燥試管3支，編號，分別加入無水乙醇1.0ml（空白管），膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml（標(biāo)準(zhǔn)管），上述乙醇提取液1.0

6、ml（樣品管），各管皆加入磷硫鐵試劑1.0ml，搖勻，10min后，分別轉(zhuǎn)移至比色杯內(nèi)，用可見分光光度計在560nm處比色。,注：磷硫鐵試劑須沿管壁緩緩加入，與乙醇液分成兩層，立即迅速振搖20次，放置10分鐘（冷卻至室溫）后，于560nm進(jìn)行比色，以空白管調(diào)零讀取各管吸光度。,六、計算,100ml血清中膽固醇的質(zhì)量（mg） A1C0 m= ÷0.04×100

7、 A0,,注意事項：,1、顏色反應(yīng)與加磷硫鐵試劑混合時的產(chǎn)熱程度有關(guān)，因此，所用試管口徑和厚度要一致；加磷硫鐵試劑必須與乙醇分成兩層，然后混合，不能邊加邊搖，否則顯色不完全；磷硫鐵試劑要加一管混合一管，混合的手法、程度也要一致；混合時試管發(fā)熱，注意勿使試管內(nèi)液體濺出，以免損傷衣服、皮膚和眼睛。,2、所用試管和比色杯均須干燥，濃硫酸的質(zhì)量很重要，放置日久，往往因為吸收水分，而使顏色

8、反應(yīng)降低。3、空白管應(yīng)接近無色，如帶橙黃色，表示乙醇不純，應(yīng)用去醛處理。,移液槍的使用,吸嘴的安裝,散裝吸嘴安裝,,盒裝吸嘴安裝,注意事項,錯誤操作：在將槍頭套上移液槍時，很多人會使勁地在槍頭盒子上敲幾下。這樣會導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件（如彈簧）因敲擊產(chǎn)生的瞬時撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住，嚴(yán)重的情況會將白套筒折斷。正確操作：將移液器垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動即可使其緊密結(jié)合。,設(shè)定容量,,注意事項,1、移液

9、器要在規(guī)定的容量內(nèi)使用，切勿超量程使用，否則會卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞了移液器。 2、調(diào)整容量時，如果從大到小時，可以直接調(diào)到想要的容量；如果從小到大時，一定要調(diào)超三分之一圈，然后再調(diào)回來，這樣做可以使彈簧完全放開,而且移液器總是在順時針運轉(zhuǎn)可以延長移液器的使用壽命。,移液,1.連接恰當(dāng)?shù)奈欤?.按下控制鈕至第一檔（在空氣中）； 3.將移液器吸嘴垂直進(jìn)入液面下1- -6mm（視移液器容量大小而定）注：為使測量準(zhǔn)確可將吸嘴預(yù)洗

10、3 次，即反復(fù)吸排液體3 次。,,4.使控制鈕緩慢滑回原位； 5.移液器移出液面前略等1- -3秒；1000ul 以下停頓 1 秒；5- -10ml停頓2- -3秒6.緩慢取出吸嘴，確保吸嘴外壁無液體。,排液,1.將吸嘴以一定角度抵住容量內(nèi)壁；2.緩慢將控制鈕按至第一檔并等待約1－3秒；3.將控制鈕按至第二檔過程中，吸嘴將剩余液體排凈，可反復(fù)在1,2檔間按壓，確保排凈；4.慢放控制鈕；

11、5.按壓彈射鍵彈射出吸嘴。,移液,一是前進(jìn)移液法。用大拇指將按鈕按下至第一停點，然后慢慢松開按鈕回原點。接著將按鈕按至第一停點排出液體，稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點吹出殘余的液體。最后松開按鈕。二是反向移液法。此法一般用于轉(zhuǎn)移高粘液體、活性液體、易起泡液體或極微量的液體。其操作是先按下按鈕至第二停點，慢慢松開按鈕至原點。接著將按鈕按至第一停點排出設(shè)置好量程的液體，繼續(xù)保持按住按鈕位于第一停點（千萬別再往下按），取下有殘留液體的槍頭，

12、棄之。,移液槍的養(yǎng)護(hù)及注意事項,1.當(dāng)移液器吸嘴有液體時切勿將移液器水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞。 2.移液器使用完畢后，把移液器量程調(diào)至最大值，且將移液器垂直放置在移液器架上。3.如液體不小心進(jìn)入活塞室應(yīng)及時清除污染物。,,4.平時檢查是否漏液的方法：吸液后在液體中停1- -3 秒觀察吸頭內(nèi)液面是否下降；如果液面下降首先檢查吸頭是否有問題，如有問題更換吸頭，更換吸頭后液面仍下降說明活塞組件有問題，應(yīng)找專業(yè)維修人