實時熒光定量pcr技術(shù)與應(yīng)用

1、實時熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用,胡亮 15171469708,提綱,PCR概念,什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶鏈反應(yīng)是在體外選擇性的擴(kuò)增特定DNA片段的方法。,,,,,,,,,Classic PCR,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Classic PCR,PCR 循環(huán),第一步 加熱變性、雙鏈打開,,,第二步退火

2、、引物與單鏈結(jié)合,第三步 - 引物延伸,變?yōu)閮蓚€雙鏈DNA,常規(guī)PCR,常規(guī)PCR技術(shù)：PCR后借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析,提綱,定量PCR,,定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析,Qtower2.2,,PCR反應(yīng)混合物,提綱,SYBR Green 1,TaqMan,熒光化學(xué),SYBR Green I,SYBR Green

3、 1,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1染料結(jié)合狀態(tài)時熒光強(qiáng)度是非結(jié)合狀態(tài)的800-1000倍,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,SYBR Green I,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,SYBR Green

4、I,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,SYBR Green I,與傳統(tǒng)PCR的比較,實現(xiàn)了初始模板的絕對定量檢測靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以對初始模板含量差異較大的樣品同時定量省時省力檢測設(shè)計靈活,Melt Curve Analysis,Melt Curve Analysis,SYBR Green I 優(yōu)點,使用方便 --- 不必設(shè)計復(fù)雜的熒光探針 沒有序列特異性

5、 --- 可以用于不同的模板 便宜 靈敏,SYBR Green I 缺點,與非特異性產(chǎn)物結(jié)合,,TaqMan,探針,熒光素,淬滅劑,TaqMan,水解型雜交探針,TaqMan,目標(biāo)特異性探針 5’為熒光素， 3’為淬滅劑,與目標(biāo)序列互補(bǔ),,,,,,,,,,,TAQMAN Probes,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,TAQMAN Probes,

6、,,,,,TAQMAN Probes,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,TAQMAN Probes,TaqMan優(yōu)點,對目標(biāo)序列有很高的特異性 ---特別適合于SNP檢測,TaqMan缺點,價格較高 只適合于一個特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析

7、 背景高,兼容化學(xué)試劑總結(jié),熒光曲線,隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖,定量原理,如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析 引入兩個概念： 熒光閾值、Ct值,定量原理,熒光閾值,在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)),閾值線,定量原理,Ct值的概念,Ct值的定義是PCR

8、擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù),閾值線,提綱,絕對定量 確定初始模板的準(zhǔn)確含量 需要標(biāo)準(zhǔn)曲線 相對定量 確定樣品間初始模板的含量倍數(shù)差異 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線 不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Ct值計算 ΔCt方法 ΔΔCt方法（看家基因） Pfaffl方法（考慮擴(kuò)增效率） Vandesompele方法（多看家基因）,定量方法,借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值反推出其初始量得到未知樣品初始量絕對值,

9、Unknown contains 3108 copies,絕對定量,ΔCT 法相對定量 無均一化處理 均一化依賴于加樣的一致性,相對定量——ΔCT,Sample1 Ct1 (25) Sample2 Ct2 (22)ΔCT=Ct1-Ct2 =25-22=3基因表達(dá)量Sample1/Sample2=2 –ΔCT= 2-3=1/8,相對定量——ΔΔCT,ΔΔCT法相對定量

10、 考慮到了加樣誤差 通常使用看家基因來完成均一化處理,Sample1 Ct1(25) Sample2 Ct2(22)內(nèi)參基因 actin Ct 01 20 Ct02 21ΔCT1= Ct1-Ct01=25-20=5 ΔCT2=Ct2-Ct02=22-21=1ΔΔCT= ΔCT1- ΔCT2

11、=5-1=4基因表達(dá)量Sample1/sample2=2- ΔΔCT=2-4=1/16,Simple,Complex,,2??CT 假定目的基因與看家基因的 擴(kuò)增效率都是100% 只有一個看家基因 Pfaffl Modification 考慮到擴(kuò)增效率的影響 只有一個看家基因 Vandesompele Method 考慮到擴(kuò)增效率的影響 有多個看家基因,相對定量,利用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，定量結(jié)果相除得到倍數(shù)差別

12、同時建立兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線 一條目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線 至少再做一條看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線 借助標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)擴(kuò)增效率的影響,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對定量分析,相對定量——標(biāo)準(zhǔn)曲線法,進(jìn)行可靠的定量實驗需要對引物對進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計 用于優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù) 引物設(shè)計 擴(kuò)增片段選擇 試劑的濃度 循環(huán)條件 變性溫度和退火溫度,PCR體系優(yōu)化,利用動態(tài)溫度梯度功能一次實現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化,退火溫度的優(yōu)化,溶解曲線,擴(kuò)增曲線,1.

13、 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, h

14、old 1 sec.,退火溫度的優(yōu)化,實時熒光定量PCR應(yīng)用,定量： DNA定量 RNA定量定性： SNP分析 基因型分析 RNA變異分析 融解曲線分析,定量PCR應(yīng)用I-實時定量,定量PCR應(yīng)用II：終點讀板,,? 基因突變分析–單基因遺傳病診斷，如血友病、地貧? SNP掃描–疾病相關(guān)基因鑒定，如牛皮癬、哮喘相關(guān)基因SNP的鑒定–SNP檢測與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，如抗高血壓藥物療效的個體差異–藥物副反