一抗、二抗的選擇

1、一抗、二抗的選擇,,一抗的選擇,1.分析實(shí)驗(yàn)應(yīng)用類型WB（Western Blot 免疫印跡 ）IHC （immunohistochemistry免疫組織化學(xué)）ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ）,2.樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域 全長(zhǎng)蛋白、蛋白片段、多肽、 細(xì)菌、細(xì)胞 樣本的提取和處理過(guò)程某些抗體要求樣本經(jīng)過(guò)

2、某些特殊處理，例如：許多抗體只識(shí)別還原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，某些抗體僅識(shí)別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織，另一些抗體則適用于無(wú)需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，,蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域,,用含此片段域的免疫原制備出的抗體。,用FACS流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白,,用含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。,,3.樣本的物

3、種 選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說(shuō)明書(shū)上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過(guò)，應(yīng)通過(guò)序列比對(duì)的方法來(lái)預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy 和 NCBI BLAST來(lái)進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。,4.一抗宿主物種的選擇一般說(shuō)來(lái)，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無(wú)

4、偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG的細(xì)胞裂解物

5、樣本的western blotting檢測(cè)，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測(cè)中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。,二抗的選擇,1.一抗的種屬來(lái)源 二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源，,2.二抗的種屬來(lái)源 一般來(lái)說(shuō)，不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒(méi)有必然的聯(lián)系，來(lái)源于山

6、羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒(méi)有太多的差別。在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的，一個(gè)是小鼠來(lái)源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來(lái)源的。,3二抗的偶聯(lián)標(biāo)記 主要有酶（辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金顆

7、粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗；細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用Biotin/Avidin檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。,4

8、.是否經(jīng)過(guò)血清吸附過(guò)的二抗為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合，可選擇經(jīng)過(guò)血清吸附過(guò)的二抗如檢測(cè)樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的特異性要求很高，選擇經(jīng)過(guò)人血清吸附過(guò)的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過(guò)人血清吸附而排除了與人源組織（如IgG等）可能發(fā)生非特異性反應(yīng)的IgG，因此將非特異性結(jié)合降低到最低。,5.二抗的類別亞型IgM是體液免疫應(yīng)答首先產(chǎn)生的Ig。IgA是機(jī)體黏膜防御感染的重

9、要因素。IgG是初級(jí)免疫應(yīng)答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgGIgE是同速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生有關(guān)的Ig。IgD以膜結(jié)合形式存在于B細(xì)胞，在B細(xì)胞分化發(fā)育中起重調(diào)節(jié)有作用,,IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗

10、體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。,免疫球蛋白在不同疾病的濃度高低  IgG 正常情況下，臍血IgG含量為7.6～17g/L；血IgG含量新生兒為7.0～14.8 g/L，0.5～6個(gè)月為3～10.0 g/L，6個(gè)月～2歲為5～12 g/L，2～6歲為5～13g/L，6～12歲為7～16.5g/L，12～16歲為7～15.5g/L

11、，成人為6～16g/L。IgG增高：患慢性肝病、亞急性或慢性感染、結(jié)締組織疾病、IgG骨髓瘤、無(wú)癥狀性單克隆IgG病等；IgG降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、混合性免疫缺陷綜合征、選擇性IgG缺乏癥、蛋白丟失性腸病、腎病綜合癥、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、免疫抑制劑治療等情況下。  IgA 正常情況，臍血IgA含量為0～50mg/L; 血內(nèi)IgA含量新生兒為0～22mg/L，0.5～6個(gè)月為3～820mg/L，7個(gè)月～2歲

12、為140～1080 mg/L，2～6歲為230～1900mg/L，6～12歲為290～2700mg/L，12～16歲為810～2320mg/L，成人為760～3900mg/L。IgA增高：在慢性肝病，亞急性或慢性感染性疾病（如結(jié)核、真菌感染等）、自身免疫性疾?。ㄈ鏢LE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）、囊性纖維化、家族性嗜中性粒細(xì)胞減少癥、乳腺癌、IgA腎病、IgA骨髓瘤等情況下；IgA降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、免疫缺陷病、選擇性IgA缺乏

13、癥、無(wú)γ－球蛋白血癥、蛋白丟失性腸病、燒傷、抗IgA抗體綜合癥、免疫抑制劑治療、妊娠后期等情況下。    IgM 正常情況下，臍血IgM含量為40～240mg/L，血內(nèi)IgM含量新生兒為50～300mg/L，0.5～6個(gè)月為150～1090mg/L，6個(gè)月～2歲為430～2390mg/L，2～6歲為500～1990mg/L， 6～12歲為500～2600mg/L，12～16歲為450～2400mg/L，成人為4

14、00～3450mg/L。IgM增高：在胎兒宮內(nèi)感染、新生兒TORC H綜合癥、慢性或亞急性感染、瘧疾、傳染性單核細(xì)胞增多癥、支原體肺炎、肝病、結(jié)締組織疾病、巨球蛋白血癥，無(wú)癥狀性單克隆IgM病等情況下，；IgM降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、混合性免疫缺陷綜合癥、選擇性IgM缺乏癥、蛋白丟失性腸病、燒傷、抗Ig抗體綜合癥（混合性冷球蛋白血癥）、免疫抑制等情況下，。,IgM是由五個(gè)單體組成的五聚體，含10個(gè)重鏈和10個(gè)輕鏈，具有10

15、個(gè)抗原結(jié)合價(jià)，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長(zhǎng)期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。因此IgM抗體的測(cè)定，對(duì)某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價(jià)值。 IgM 是抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的Ig ，Ig

16、M 不是細(xì)胞，但可結(jié)合補(bǔ)體，主要分布于血清中。由于IgM 有較高的結(jié)合價(jià)，所以是高效能的抗生物抗體，其殺菌、溶菌、促吞噬和凝集作用比IgG 高500- 1000 倍，IgM 在機(jī)體的早期防御中起著重要的作用。,IgM,IgA 分血清型和分泌型兩種，血清型多為單體，也有二聚體，血清型IgA可介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC 作用；分泌型的都是二聚體，且含有分泌片。分泌型IgA（SIgA）是機(jī)體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分，覆蓋在鼻、咽、氣管、腸和膀胱

17、粘膜的表面，它能抑制微生物在呼吸道上皮附著，減緩病毒繁殖，是粘膜重要屏障，對(duì)某些病毒、細(xì)菌和—般抗原具有抗體活性，是防止病原體入侵機(jī)體的第一道防線。外來(lái)抗原進(jìn)入呼吸道或消化道，局部免疫系統(tǒng)受到刺激后，無(wú)需中央免疫系統(tǒng)的參與，自身就可進(jìn)行免疫應(yīng)答，產(chǎn)生分泌型抗體，即SIgA。已有研究證明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影響呼吸道粘膜對(duì)病原體的抵抗力，兩者呈正相關(guān)。初乳中含有分泌型的sIgA　。IgA的凝聚物可以通過(guò)經(jīng)典途徑

18、激活補(bǔ)體。,IgA,人體血清免疫球蛋白IgG是初級(jí)免疫應(yīng)答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgG，它在抗感染中起到主力軍作用，它能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用（調(diào)理作用），中和細(xì)菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原結(jié)合使病毒失去感染宿主細(xì)胞的能力（中和病毒）。IgG 在機(jī)體合成的年齡要晚于IgM，在出生后第3 個(gè)月開(kāi)始合成，3-5 歲接近成年人水平。它是唯一能通過(guò)胎盤的Ig，在自然被動(dòng)免

19、疫中起重要作用。此外，IgG 還具有調(diào)理吞噬和結(jié)合SPA等作用。,IgG,【Anti-IgG還是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，通常含有較多的Fc受體，這時(shí)候選擇二抗時(shí)最好選擇Anti-IgG, F（ab’）2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結(jié)合。常規(guī)的Anti-IgG （H+L）二抗與IgG的重

20、鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng)，即與IgG的Fc的F（ab’）2片段都能結(jié)合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此Anti-IgG （H+L）與它們都有交叉反應(yīng)。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment經(jīng)過(guò)了IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F（ab’）2片段結(jié)合。,針對(duì)某一種屬的抗體可能會(huì)和其他一些種屬有交叉反應(yīng)。牛血清白蛋白和奶粉可能含有與抗牛IgG、抗山羊IgG、抗馬IgG、抗綿羊IgG等抗體反應(yīng)的Ig