③tk基因突變試驗

1、第九章 食品安全性評價與預(yù)警,第一節(jié) 毒理學(xué)安全性評價概述,一、基本概念 毒理學(xué)安全性評價是通過動物實驗和對人群的觀察，闡明食品中的某種物質(zhì)（含食品固有物質(zhì)、添加物質(zhì)或污染物質(zhì)）的毒性及潛在的危害，對該物質(zhì)能否投入市場做出安全性的評估或提出人類安全接觸的條件，以達到最大限度的減小其危害作用、保護人民身體健康的目的。 對人類食用這種物質(zhì)的安全性做出評價的研究過程稱為食品毒理學(xué)安全性評價。,應(yīng)用食品毒理學(xué)的方法對食品進行安

2、全性評價, 為我們正確認識和安全使用食品添加劑(包括營養(yǎng)強化劑)、開發(fā)食品新資源和新資源食品及保健食品的開發(fā)提供了可靠的技術(shù)保證，為我們正確評價和控制食品容器和包裝材料、輻照食品、食品及食品工具與設(shè)備用洗滌消毒劑、農(nóng)藥殘留及獸藥殘留的安全性提供了可靠的操作方法。,二、安全性評價程序的概況及意義,1.毒理學(xué)安全性評價的法律法規(guī),①1994年8月10日批準通過中華人民共和國國家標準 現(xiàn)行GB15193.1-2003 《食品安全性毒理學(xué)評價

3、程序》②1991年12月頒發(fā)了《農(nóng)藥安全性毒理學(xué)評價程序》。 ③1984年9月20日《中華人民共和國藥品管理法》， 1988年衛(wèi)生部頒布《新藥(西藥)毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則》 ④1987年5月28日國家標準《化妝品安全性評價程序和方法》 ⑤1993年5月發(fā)布了《保健食品功能毒理學(xué)評價程序和檢驗方法(試行)》 ⑥1987年國務(wù)院發(fā)布《化學(xué)危險品安全管理條例》,2.我國食品安全性毒理學(xué)評價法律法規(guī)和標準,食品安全性毒理學(xué)評價程序和試

4、驗方法（共21個標準）GB 15193.1-2003 食品安全性毒理學(xué)評價程序GB15193.2-2003 食品毒理學(xué)實驗室操作規(guī)范GB 15193.3-2003 急性毒性試驗 GB15193.4-2003 鼠傷寒沙門氏菌 哺乳動物微粒體酶試驗GB15193.5-2003 骨髓細胞微核試驗GB15193.6-2003哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗GB15193.7-2003 小鼠精子畸形試驗,GB 15193.8-2003

5、 小鼠睪丸染色體畸變試驗GB 15193.9-2003 顯性致死試驗GB 15193.10-2003 非程序性DNA合成實驗GB 15193.11-2003 果蠅伴性隱性致死試驗GB 15193.12-2003 體外哺乳類細胞(V79/HGPRT)基因突變試驗GB 15193.13-2003 30天和90天喂養(yǎng)試驗 GB 15193.14-2003致畸試驗,GB 15193.15-2003 繁殖試驗GB 15193.16-

6、2003 代謝試驗GB 15193.17-2003 慢性毒性和致癌試驗 GB 15193.18-2003 日容許攝入量(ADI)的制定 GB 15193.19-2003 致突變物、致畸物和致癌物的處理方法 GB 15193.20-2003 TK基因突變試驗 GB 15193.21-2003 受試物處理方法,為了保證毒理學(xué)實驗結(jié)果的正確性，還必須規(guī)范整個毒理學(xué)實驗條件和實驗過程，其目的是規(guī)范試驗方法和實驗數(shù)據(jù)的收集和整理過程，確

7、保實驗數(shù)據(jù)的可靠性和可比性，以便管理部門據(jù)此做出正確決策。,為此，世界上一些國家和組織研究制定了毒理學(xué)良好實驗室規(guī)范（Good laboratory practice， GLP），我國也在近年制定了GB15193.2-2003《食品毒理學(xué)實驗室操作規(guī)范》。 根據(jù)我國衛(wèi)生法規(guī)的規(guī)定：食品、食品添加劑、農(nóng)藥、獸藥、工業(yè)化學(xué)品等各類可以經(jīng)食物鏈進入人體的化學(xué)物質(zhì)必須經(jīng)過安全性評價，才能允許投產(chǎn)，進入市場或進行國際貿(mào)易。,國際性組織,

8、（1）食品法典委員會（CAC）（2）國際化學(xué)品安全規(guī)劃署（IPCS）（3）國際潛在有毒化學(xué)物登記中心（4）國際腫瘤研究中心（IARC）（5）經(jīng)濟合作和發(fā)展組織（OECD）,三、毒理學(xué)安全性評價的內(nèi)容,毒理學(xué)評價采取分階段進行的原則：它將各種毒性試驗按一定順序進行，通常先行安排試驗周期短、費用低、預(yù)測價值高的試驗。 不同種類物質(zhì)的評價程序?qū)Χ拘栽囼瀯澐值碾A段性有不同的要求，《食品安全性毒理學(xué)評價程序》將毒性試驗分為四個階

9、段。,1.毒理學(xué)安全性評價的前期準備工作,試驗前應(yīng)該了解受試物的基本資料，了解受試物的成分、規(guī)格、用途、使用范圍，以此了解人類可能接觸的途徑和劑量，過度接觸以及濫用或誤用的可能性等，以便預(yù)測毒性和進行合理的試驗設(shè)計。,（1）收集受試物質(zhì)的基本資料 在毒性試驗之前要求了解受檢物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，根據(jù)結(jié)構(gòu)式可能預(yù)測一些化學(xué)物質(zhì)的毒性大小和致癌活性； 了解受檢物質(zhì)的組成成分和雜質(zhì)，以及理化性質(zhì)如熔點、沸點、密度、水

10、溶性或脂溶性、溶解度、乳化性或混懸性、儲存穩(wěn)定性等； 還要了解受試物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的定性和定量分析方法。,（2）了解受試物質(zhì)的使用情況 包括該物質(zhì)的使用方式及人體接觸途徑、用途及使用范圍、使用量。 如果受試物曾被人群接觸過，應(yīng)收集人群流行病學(xué)資料，若有中毒事故的調(diào)查與記載可提供人體中毒和效應(yīng)的資料。,（3）選用與人類實際接觸的產(chǎn)品形式做好受試材料 用于毒理學(xué)安全性評價的受試

11、物應(yīng)采用與人類實際接觸的工業(yè)化產(chǎn)品或市售產(chǎn)品，而非純化學(xué)品，以反映人體實際接觸的情況。 實驗過程中的受試物必須是均勻的、規(guī)格一致的產(chǎn)品。當(dāng)需要確定該化學(xué)品的毒性來源于化學(xué)物質(zhì)還是所含雜質(zhì)時，通常采用純品和應(yīng)用品分別試驗，再將結(jié)果進行比較。,2.食品毒理學(xué)安全性評價不同階段的毒理學(xué)項目,食品毒理學(xué)安全性按照國家規(guī)定的程序可以劃分為四個階段的試驗研究，根據(jù)各個階段的試驗結(jié)果并結(jié)合人群流行病學(xué)資料即可進行安全性評價。,常用的安

12、全性評價的毒理學(xué)項目,表9-1 食品安全性毒理學(xué)評價與試驗?zāi)康?第二節(jié) 食品安全性毒理學(xué)評價程序,衛(wèi)生部2003年頒布的GB 15193.1-2003《食品安全性毒理學(xué)評價程序》是開展食品安全性毒理學(xué)評價的標準程序。 適用于評價食品生產(chǎn)、加工、保藏、運輸和銷售過程中使用的化學(xué)和生物物質(zhì)以及在這些過程中產(chǎn)生和污染的有害物質(zhì)，食品新資源及其成分，也適用于食品中其它的有害物質(zhì)。,一、評價程序分階段試驗具體內(nèi)容,1.第一階段

13、 急性毒性試驗，主要測試其經(jīng)口急性毒性，包括LD50和聯(lián)合急性毒性最大耐受劑量法。2.第二階段 遺傳毒性試驗，傳統(tǒng)致畸試驗和30天喂養(yǎng)試驗。（1）遺傳毒性試驗 目的是對受試物的遺傳毒性以及是否具有潛在的致癌作用進行篩選。 在選擇和組合遺傳毒性試驗時必須考慮原核細胞和真核細胞、體內(nèi)和體外試驗相結(jié)合的原則。,主要試驗為：①細菌致突變試驗：Ames試驗為首選項目，或V79/HGP

14、RT 基因突變試驗；②骨髓細胞微核試驗或哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗；③TK基因突變試驗，小鼠精子畸形分析或睪丸染色體畸變分析；④其它備選遺傳毒性試驗：顯性致死試驗、果蠅伴性隱性致死試驗、程序外DNA修復(fù)合成（UDS）試驗。,（2）傳統(tǒng)致畸試驗 目的是為了了解受試物對胎仔是否具有致畸作用。（3）30d喂養(yǎng)試驗 如受試物需進行第三、第四階段毒性試驗者，可不進行本試驗。,3.第三階段,亞慢性毒性試驗，

15、包括90d喂養(yǎng)試驗、繁殖試驗以及代謝試驗。（1）90d喂養(yǎng)試驗旨在觀察受試物以不同劑量水平經(jīng)較長時期喂養(yǎng)后對動物的毒性作用性質(zhì)和靶器官，并初步確定最大無作用劑量。（2）繁殖試驗?zāi)康脑谟诹私馐茉囄飳游锓敝臣皩ψ哟闹禄饔?，為慢性毒性和致癌試驗的劑量選擇提供依據(jù)。,（3）代謝試驗也是本階段常選的試驗，目的是了解受試物在體內(nèi)的吸收、分布和排泄速度以及蓄積性，尋找可能的靶器官，并為選擇慢性毒性試驗的合適動物種系提供依據(jù)和了解有無毒性代謝

16、產(chǎn)物的形成。,4.第四階段,慢性毒性試驗（包括致癌試驗） 通過本階段的試驗，了解經(jīng)長期接觸受試物后出現(xiàn)的毒性作用，尤其是進行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用，最終確定最大無作用劑量，為受試物能否應(yīng)用于食品的最終評價提供依據(jù)。,二、毒性試驗的選用原則,毒性試驗的選用原則包括：（1）我國創(chuàng)新的物質(zhì)要求進行全部四個階段的試驗。特別是對其中化學(xué)結(jié)構(gòu)提示有慢性毒性、遺傳毒性或致癌性可能者或產(chǎn)量大、使用范圍廣和收入機會多者，必須進

17、行全部四個階段的毒性試驗。,（2）與已知物質(zhì)（指經(jīng)過安全性評價并允許使用者）的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本相同的衍生物或類似物，根據(jù)第一、二、三階段毒性試驗結(jié)果判斷是否需要進行第四階段的毒性試驗。（3）當(dāng)受試物為已知的化學(xué)物質(zhì)，WHO已公布每人每日允許攝入量（ADI），而且申請單位有資料證明我國產(chǎn)品的質(zhì)量規(guī)格與國外產(chǎn)品一致時，則先進行第一、二階段毒性試驗，否則應(yīng)進行第三階段的毒性試驗。,（4）食品添加劑、食品新資源和新資源食品、輻照食品、食品工具及設(shè)

18、備用清洗消毒劑的安全性毒理學(xué)評價試驗的選擇：①食品添加劑：包括香料、其他食品添加劑、進口食品添加劑、食品新資源和新資源食品、輻照食品和食品工具設(shè)備用清洗消毒劑。,香料：鑒于食品中使用的香料品種很多，化學(xué)結(jié)構(gòu)很不相同，而用量則很少，在評價時可參考國外的資料和規(guī)定，分別決定需要進行的試驗。詳見GB15193.1-2003《食品安全性毒理學(xué)評價程序》其他食品添加劑：詳見GB15193.1-2003《食品安全性毒理學(xué)評價程序》。進口食品添

19、加劑：要求進口單位提供毒理學(xué)資料及出口國批準使用的資料，由省、市、自治區(qū)一級食品衛(wèi)生監(jiān)督檢疫機構(gòu)提出意見報衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所審查后決定是否需要進行毒性試驗。,②食品新資源和新資源食品：原則上應(yīng)進行第一、二、三階段毒性試驗以及必要的人群流行病學(xué)調(diào)查，必要時應(yīng)進行第四階段試驗。 若根據(jù)有關(guān)文獻及成分分析未發(fā)現(xiàn)有或雖有但含量甚少，不至于構(gòu)成對健康有害的物質(zhì)，以及較大數(shù)量人群有長期使用歷史而未發(fā)現(xiàn)有害作用的天然植物（包括作為調(diào)料的天

20、然動植物的粗提制品）可以先進行第一、二階段毒性試驗，經(jīng)初步評價后，決定是否需要進行下一步的毒性試驗。,③輻照食品：按《輻照食品衛(wèi)生管理辦法》要求提供毒理學(xué)試驗資料。④食品工具設(shè)備用清洗消毒劑：按衛(wèi)生部頒布的《消毒管理辦法》進行。,三、食品安全性毒理學(xué)評價試驗的結(jié)果判定,1.急性毒性試驗 當(dāng)LD50小于人的可能攝入量的10倍時，應(yīng)放棄將該受試物用于食品，不再繼續(xù)其他的毒理學(xué)試驗；如大于10倍，可進入下一階段的毒理學(xué)試驗。當(dāng)L

21、D50為人的可能攝入量的10倍左右時，應(yīng)進行重復(fù)試驗，或用另一種方法進行驗證。,我國衛(wèi)生部在《食品安全性毒理學(xué)評價程序》(2003)中對遺傳毒理學(xué)試驗的要求是：考慮原核細胞與真核細胞、體外和體內(nèi)試驗以及體細胞和生殖細胞的原則。從①Ames試驗或V79/HGPRT基因突變試驗、②骨髓細胞微核試驗或哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗、③TK基因突變試驗、小鼠精子畸形分析或睪丸染色體畸變分析選一項。其他備選遺傳毒性試驗：顯性致死試驗、果蠅伴性

22、隱性致死試驗、非程序性DNA合成試驗。,2.遺傳毒性試驗,1. 如三項試驗中，體內(nèi)、體外各有一項或以上試驗陽性，則表示該受試物很可能具有遺傳毒性和致癌作用，放棄。2. 如三項試驗中一項體內(nèi)試驗陽性或兩項體外試驗陽性，則再選兩項備選試驗（至少一項體內(nèi)試驗）。如再選的試驗均為陰性，則可繼續(xù)將進行下一步的毒性試驗；如其中有一項試驗陽性，則結(jié)合其它試驗結(jié)果，經(jīng)專家討論決定，再做其它備選試驗或進入下一步的毒性試驗。3.如三項試驗均為陰性，則可

23、繼續(xù)進行下一步的毒性試驗。,3.短期喂養(yǎng)試驗,在只要求進行兩階段毒性試驗時，若短期喂養(yǎng)試驗未發(fā)現(xiàn)明顯毒性作用，綜合其他的試驗即可做出初步的評價。若試驗中發(fā)現(xiàn)有明顯毒性作用，尤其是具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系時，應(yīng)考慮開展進一步的毒性試驗。,4.90d喂養(yǎng)試驗、繁殖試驗、傳統(tǒng)致畸試驗,根據(jù)這三項試驗中最敏感指標得出的無作用劑量（NOEL）進行評價，判別標準是：（1）當(dāng)NOEL≤人的可能攝入量的100倍，表示毒性較強，應(yīng)放棄將該受試物用于食品

24、。（2）100倍＜NOEL＜300倍，應(yīng)進行慢性毒性試驗（3）NOEL≥300倍時，可考慮允許應(yīng)用于食品。,5.慢性毒性（包括致癌）試驗,根據(jù)慢性毒性試驗所得的無作用劑量進行評價：（1）NOEL≤人的可能攝入量的50倍，表示毒性較強，應(yīng)放棄將該受試物應(yīng)用于食品。（2）50倍＜NOEL＜100倍時，經(jīng)過安全性評價后，方可決定該受試物可否用于食品。（3）NOEL≥100倍時，可考慮允許應(yīng)用于食品。,根據(jù)致癌試驗所得的腫瘤發(fā)生率、潛

25、伏期和多發(fā)性等進行致癌試驗結(jié)果判定的原則是：凡符合下列情況之一，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異者，可認為致癌試驗結(jié)果未陽性。若存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判斷陽性更可靠。 (1) 對于對照組也出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤，試驗組腫瘤發(fā)生率增加； (2) 試驗組發(fā)生對照組沒有的腫瘤類型； (3) 試驗組腫瘤發(fā)生早于對照組； (4) 與對照組比較，試驗組每個動物的平均腫瘤數(shù)增加。,6.新資源食品

26、、復(fù)合配方的飲料等,如果試樣的最大加入量（一般不超過飼料的5%）或液體試樣最大可能的濃縮物加入量仍不能達到最大無作用劑量為人的可能攝入量的規(guī)定倍數(shù)時，可考慮綜合其他的毒性試驗結(jié)果和實際食用或飲用量進行安全評價。,,,,,四、進行食品安全性評價時需考慮的問題 影響毒性鑒定和安全性評價的因素很多，進行安全性評價時需要考慮和消除多方面因素的干擾，盡可能做到科學(xué)、公正地作出評價結(jié)論。 (一) 實驗設(shè)計的科學(xué)性 (二) 試

27、驗方法的標準化 (三) 熟悉毒理學(xué)試驗方法的特點 (四) 評價結(jié)論的高度綜合性,1.動物毒性試驗和體外試驗資料《食品安全性毒性學(xué)評價程序》所列各項動物試驗和體外試驗系統(tǒng)是進行安全性評價的主要依據(jù)。因此，當(dāng)試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果，結(jié)果的判定涉及受試物能否應(yīng)用于食品時，需要考慮結(jié)果的重復(fù)性和劑量-反應(yīng)關(guān)系。,2.代謝試驗的資料 代謝研究是對化學(xué)物質(zhì)進行毒理學(xué)評價的一個重要方面，在毒性試驗中，原則上應(yīng)盡量使用與人具有相同代謝

28、途徑和模式的動物種系進行試驗。研究受試物在實驗動物和人體內(nèi)吸收、分布、排泄和生物轉(zhuǎn)化方面的差別，對于將動物試驗結(jié)果比較正確地推論到人具有重要意義。,3.由動物毒性試驗結(jié)果推論到人時 鑒于動物、人的種屬和個體之間的生物特性差異，一般采用安全系數(shù)的方法，以確保對人的安全性。安全系數(shù)通常為100倍，但可根據(jù)受試物的理化性質(zhì)、毒性大小、代謝特點、接觸的人群范圍、食品中的使用量及使用范圍等因素，綜合考慮增大或減小安全系數(shù)。,安全系數(shù)(

29、safety factor，SF): 是根據(jù)所得的無作用劑量(NOEL)提出安全限值時，為解決由動物實驗資料外推至人的不確定因素及人群毒性資料本身所包含的不確定因素而設(shè)置的轉(zhuǎn)換系數(shù)。安全系數(shù)一般采用100，據(jù)認為安全系數(shù)100是為物種間差異(10)和個體間差異(10)兩個安全系數(shù)的乘積。,4.人體資料 由于存在著動物與人之間的種族差異，在將動物試驗結(jié)果外推到人時，應(yīng)盡可能收集人群接觸受試物后反應(yīng)的資料。志愿者體內(nèi)

30、的代謝資料對于將動物試驗結(jié)果推論到人時具有重要的意義。 在確保安全的條件下，可以考慮按照有關(guān)規(guī)定進行必要的人體試食試驗。人的可能攝入量，除一般人群的攝入量外，還可考慮特殊和敏感人群的情況（如兒童、孕婦及高攝入人群）。,5.綜合評價 在進行最后評價時，除毒理學(xué)試驗結(jié)果外，還應(yīng)盡可能收集有關(guān)流行病學(xué)資料。進行綜合評價。,第三節(jié) 毒理學(xué)安全性評價的規(guī)范化,食品毒理學(xué)安全評價工作要求毒理學(xué)試驗資料準確、可靠，所獲得的資料

31、在國內(nèi)外具有可比性。我國為此頒布了GB15193.2《食品毒理學(xué)實驗室操作規(guī)范》及引入“良好實驗室規(guī)范”（GLP）管理。GLP主要包括一下幾個部分：,1.對組織機構(gòu)和人員要求要求實驗室質(zhì)量控制規(guī)范要求構(gòu)建組織體系，具有實驗質(zhì)量管理制度。要求具備一定數(shù)量的有職稱、資歷和工作經(jīng)驗的實驗人員，并接受GLP的專門培訓(xùn)。項目負責(zé)人由GLP機構(gòu)或?qū)嶒炇邑撠?zé)人任命，并有質(zhì)量檢查員與控制實驗質(zhì)量有關(guān)的職責(zé)。,2.對實驗儀器設(shè)備和實驗材料的要求

32、 要求實驗用房及設(shè)施條件滿足毒理學(xué)試驗要求，其設(shè)計復(fù)合毒性試驗的要求，對溫度、濕度、通風(fēng)防毒由特殊要求的用房，還必須配備相應(yīng)的溫控、濕控和通風(fēng)防毒的安全衛(wèi)生及防治污染的設(shè)施。,2.對實驗儀器設(shè)備和實驗材料的要求 要求實驗室具備各類毒理學(xué)實驗設(shè)備和儀器，建立儀器、設(shè)備、試劑管理制度。實驗儀器設(shè)備應(yīng)定期檢查、校正、維修、清潔以保證儀器、設(shè)備的性能符合實驗要求，試劑必須標名稱和有關(guān)說明，并有專人保管，定期檢查。實驗動

33、物管理按醫(yī)學(xué)實驗動物實施細則有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。,3.標準操作規(guī)程（SOP，Standard operation procedure） 為減少實驗過程中各種因素的干擾，使實驗結(jié)果準確、可靠而對每項實際操作項目規(guī)定的操作規(guī)程。 毒理試驗的標準操作規(guī)程主要包括：,（1）動物房及實驗室的準備及環(huán)境因素的調(diào)控，實驗設(shè)施及儀器設(shè)備的維護、保養(yǎng)、校正、使用和管理；（2）受試物和對照物的接收、標識、保存、處理、配制、領(lǐng)用及取樣分析；

34、（3）實驗動物的運輸、檢疫、編號、分配、搬運及飼養(yǎng)管理、實驗動物的觀察記錄及實驗操作、動物尸檢以及組織病理學(xué)檢查，各種實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理與計算；,（4）各種實驗樣本的采集編號及分析檢測操作技術(shù)，實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理；（5）質(zhì)量保證工作制度與措施；（6）實驗廢棄物處理及實驗操作防護措施。,4.對研究工作實施過程的要求 包括制定實驗研究計劃，計劃內(nèi)容有項目一般情況、試驗時間、試驗對象、試驗方法、擬采取的質(zhì)量控制措施。計劃經(jīng)審批調(diào)

35、整后執(zhí)行。 在實施計劃時要按標準操作規(guī)范做好試驗前的準備工作和進行試驗研究，最后撰寫試驗結(jié)果總結(jié)報告。報告經(jīng)質(zhì)量檢察員評審后交實驗室負責(zé)人審定。,5.對檔案及其管理工作的要求 實驗室應(yīng)有檔案管理制度，并由專人負責(zé)，各類實驗及質(zhì)量管理資料按性質(zhì)分類，編好索引，及時歸檔，保存期限至少2年。,6.實驗室資格認證及監(jiān)督檢查 按照GLP的要求，實驗單位必須建立獨立的質(zhì)量管理保證部門，對各種試驗全過程進行審查，包括對實