大腸桿菌與合成生

1、在大腸桿菌內(nèi)引入甲羥戊酸途徑高效合成抗瘧藥青蒿素前體——紫穗槐-4,11- 二烯,匯報人：馬納納 2019年11月2日,合成生物學：,一門生物學與工程學交叉的前沿學科, 以生命科學理論為指導, 以工程學原理進行遺傳設(shè)計、基因組改造( 重組染色體) 和（或）合成以及人造細胞合成。其中, 基因組改造( 重組染色體) 和（或）合成是關(guān)鍵。2019年5 月20日, 以克雷格·文特爾為首的美國科學家, 在Scien

2、ce上公布了人類歷史上創(chuàng)造出首個“人造單細胞生物”的消息，以這項成果為代表的合成生物學(synthetic biology, Synbio)也就受到了前所未有的關(guān)注。,,,,,合成生物學如何創(chuàng)造生命,用A 、G 、C 、T 為代表的化學物質(zhì)人工合成DNA(脫氧核糖核酸) 片段, 由DNA片段合成基因,再由基因組合成生物模塊, 然后裝配成“人造基因組”, 最終在實驗室里創(chuàng)造出全新生物體。,合成生物學與大腸桿菌,合成生物學中的底盤生物

3、是合成生物學的“硬件”基礎(chǔ)。大腸桿菌(Escherichia coli) 作為最簡單的模式生物，由于其背景清晰、生長快速、易于操作，在基礎(chǔ)生物研究以及生物技術(shù)應(yīng)用方面有著其他模式生物無可比擬的優(yōu)越性。,大腸桿菌已經(jīng)成為能源、化合物、材料及藥物 生產(chǎn)的重要平臺，合成生物學的發(fā)展促進了大腸桿菌代謝途徑的重建，通過精確設(shè)計基因環(huán)路、重構(gòu)代謝途徑為大腸桿菌提供了新的代謝和生理功能，使其能夠高產(chǎn)天然甚至非天然產(chǎn)物。 在過去的十年里，基

4、于大腸桿菌的系統(tǒng)生物學得到了迅猛發(fā)展。,大腸桿菌與青蒿素的合成,青蒿素(artemisinin) 是中國科學家于20世紀70年代從傳統(tǒng)中草藥青蒿或稱黃花蒿( Artemisia annua L.)中分離提純的抗瘧有效單體, 其化學本質(zhì)是含有“ 過氧橋” 結(jié)構(gòu)(1,2,4- 三噁烷環(huán)) 的倍半萜內(nèi)酯。以青蒿素為母核經(jīng)人工半合成獲得的青蒿素琥珀酸酯( 青蒿琥酯) 、青蒿素甲醚( 蒿甲醚) 、青蒿素乙醚( 蒿乙醚)和雙氫青蒿素等青蒿素類藥

5、物, 血中溶解性好, 生物利用度高, 對氯喹抗性瘧疾及致命性腦型瘧有特效, 已成為世界衛(wèi)生組織(WHO)倡導的“ 基于青蒿素的聯(lián)合療法”(artemisinin-based combination therapies, ACTs)首選的抗瘧新藥。,青蒿分布地域狹窄, 青蒿素含量低(0.01%~ 0.5%). 化學合成青蒿素產(chǎn)率不理想, 成本高. 隨著全球瘧疾發(fā)病率(3.8 億人/ 年) 和死亡率(4600 萬人/ 年)逐年升

6、高, 青蒿素類抗瘧藥需求量迅猛增長, 導致青蒿素原料藥供不應(yīng)求, 市場價格飆升. 近10年來, 為了從根本上解決青蒿素的供需矛盾, 國內(nèi)外爭相開展了青蒿素合成生物學及代謝工程研究, 一方面嘗試在微生物體內(nèi)重建青蒿素生物合成途徑, 另一方面對青蒿中原有的青蒿素生物合成途徑進行遺傳改良,,,大腸桿菌與青蒿素前體,大腸桿菌內(nèi)存在以脫氧木酮糖磷酸 (Deoxyxylulose-5-phosphate ，DXP) 途徑為基礎(chǔ)的類異戊

7、二烯代謝途徑，能合成少量的輔酶Q 等。故大腸桿菌非常適合作為生物合成類異戊二烯化合物的宿主菌。本研究在大腸桿菌中引入人工合成的紫穗槐- 4,11- 合酶基因并構(gòu)建原核的糞腸球菌 Enterococcus faecalis 來源的MVA途徑，獲得了抗瘧藥青蒿素前體——紫穗槐-4,11- 二烯的高表達。這種微生物半合成青蒿素的方法——先通過改造微生物合成途徑獲得青蒿素的前體紫穗槐- 4,11-二烯或青蒿酸等，再采用相對簡單的化

8、學催化步驟可將這些前體轉(zhuǎn)化成青蒿素，可以大規(guī)模制備青蒿素，解決資源短缺問題。,基本思路：首先在大腸桿菌Escherichia coli DHGT7 中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大腸桿菌內(nèi)源的法尼基焦磷酸，成功獲得了紫穗槐-4,11- 二烯。為提高前體供給，引入糞腸球菌的甲羥戊酸途徑，紫穗槐-4,11- 二烯的產(chǎn)量提高了13.3 倍，達到151 mg/L。進一步研究發(fā)現(xiàn)了3 個限制酶，分別是紫穗槐-4,11

9、- 二烯合酶、HMG-COA 還原酶和甲羥戊酸激酶；通過調(diào)節(jié)這些酶的水平，紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量提高了7.2 倍，在搖瓶中達到235 mg/L。,1. 載體構(gòu)建、目的基因表達,采用常用分子克隆技術(shù)，如PCR 擴增、酶切、 連接和轉(zhuǎn)化等構(gòu)建質(zhì)粒表達載體 。,,將表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli DHGT7 ，接入含相應(yīng)抗生素 (Kn、Cm 均為25 μg/mL) 的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600 =0.3~0

10、.4 ，加入 0.2％ L-阿拉伯糖誘導，繼續(xù)培養(yǎng)4~5 h 。取菌體全蛋白作SDS-PAGE 分析,以 pET28a 為對照。結(jié)果在約56 kDa 處有可見的紫穗槐-4,11- 二烯合酶 (ADS) 的條帶 。,2. 搖瓶培養(yǎng)方法,挑取新轉(zhuǎn)化的單克隆，接入含相應(yīng)抗生素的液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接40 mL 抗性FM2G 培養(yǎng)基，使初始菌體濃度為OD600=0.05，37 ℃、220 r/min

11、振蕩培養(yǎng)至OD600 為0.3~0.4 時，加入0.2％ L- 阿拉伯糖或0.5 mmol/L IPTG 誘導，并加入20％ ( V / V ) 無菌的十二烷覆蓋在培養(yǎng)基的表面，隨后轉(zhuǎn)至30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48~60 h。選取不同時間點測定菌體濃度和紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量。,GC-MS法測定AD含量,新轉(zhuǎn)化的菌株pET28-ADS/DHGT7 進行搖瓶培養(yǎng)，采用GC-MS法測定紫穗槐-4,11- 二烯的含量。通過GC檢測，分別在8.

12、42 min和8.83 min 出現(xiàn)內(nèi)標物石竹烯 (IS) 和紫穗槐-4,11- 二烯 (AD) 的保留峰 。,,根據(jù)內(nèi)標石竹烯的濃度對樣品AD 含量進行定量，結(jié)果搖瓶培養(yǎng)48 h 的紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量僅為11.3 mg 石竹烯當量/L 。我們推測大腸桿菌內(nèi)源的FPP 水平太低，限制了紫穗槐-4,11- 二烯的產(chǎn)量，因此提高胞內(nèi)FPP 水平是提高紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵。由于大腸桿菌僅存在DXP途徑，為避免對

13、內(nèi)源途徑的影響，后面引入了異源的 MVA途徑來提高前體供給。,3. 構(gòu)建異源MVA途徑,以低拷貝質(zhì)粒pACYCDuet-1 的骨架為基礎(chǔ)，PCR 擴增質(zhì)粒pET3b 的多克隆位點 (MCS)，并通過PCR 引物引入NotⅠ和Apa Ⅰ限制性酶切位點，將PCR 擴增的MCS序列連接到pACYCDuet-1 的Sph Ⅰ和Eco R Ⅰ之間，構(gòu)建了具有特殊 MCS的質(zhì)粒載體pAOC3ANL，用于多基因合成途徑的構(gòu)建。 將糞腸球菌來源的m

14、vaE、mvaS、MD 和ispA與ADS 分別構(gòu)建在質(zhì)粒載體pAOC3ANL 和pET28a上，得到表達載體pAOC3-ES-MD 和pET28-ispA- ADS，共轉(zhuǎn)化E. coli DHGT7 ，搖瓶培養(yǎng)48 h ，紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量達到151 mg/L，是利用內(nèi)源FPP的13.3 倍。,,4. 優(yōu)化紫穗槐-4,11- 二烯合成途徑,將整個紫穗槐-4,11- 二烯合成途徑的基因構(gòu)建 到單個質(zhì)粒載體 pAOC3A

15、NL 上，得到表達載體pAOC3-ES-MD-ispA-ADS ( 圖4），轉(zhuǎn)化E.coli DHGT7，紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量為32.5 mg/L，僅為使用2 個質(zhì)粒共表達時的1/5，菌體的生長也受到嚴重抑制 ( 圖5A) 。,推斷這是因為當使用2 個質(zhì)粒共表達時ADS 是構(gòu)建在高拷貝的pET28a 上，而以單個質(zhì)粒表達時 ADS 是構(gòu)建在低拷貝的pAOC3ANL 上，間接地降低了ADS 的拷貝數(shù)，使得胞內(nèi)FPP 累積，

16、引起內(nèi)源FPP 合成途徑的反饋調(diào)控作用，從而抑制菌體生長。,提高ADS 的拷貝數(shù)，將pET28-ADS與pAOC3-ES-MD-ispA-ADS 共轉(zhuǎn)化 E. coli DHGT7，結(jié)果紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量提高了4.3 倍，達到140 mg/L ( 圖5B) ，菌體生長抑制也得到一定程度的緩解。,HMG-CoA 還原酶是類異戊二烯化合物生物合成過程中的關(guān)鍵酶，其活性不足會導致HMG-CoA 在胞內(nèi)累積產(chǎn)生毒性。因此，我

17、們提高HMG-CoA 還原酶水平，構(gòu)建了表達載體pET28-E-ADS，pAOC3 ES-MD-ispA-ADS 共轉(zhuǎn)化E. coli DHGT7 ，結(jié)果菌體生長抑制得到進一步緩解，紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量也再次提高。 另外，提高胞內(nèi)甲羥戊酸激酶 (MK) 的水平可以極大地提高紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量。因此我們構(gòu)建了表達載體pET28-E-MK-ADS，與pAOC3-ES-MD-ispA-ADS 共轉(zhuǎn)化E. coli D

18、HGT7 ，結(jié)果紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量達到235 mg/L，是優(yōu)化前的7.2 倍，菌體生長抑制基本消除。,結(jié)論,本研究利用大腸桿菌為宿主，構(gòu)建異源紫穗槐- 4,11-二烯從頭合成途徑，并對合成途徑進行優(yōu)化，通過提高紫穗槐-4,11- 二烯合酶、HMG-COA 還原酶和甲羥戊酸激酶等3 個酶的水平，消除了抑制菌體生長的不利因素，使紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量達到235 mg/L。繼續(xù)對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等進行優(yōu)化，或通過上罐發(fā)酵，將獲

19、得更高的紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量。這為高效生物合成抗瘧藥青蒿素前體——紫穗槐-4,11- 二烯奠定了基礎(chǔ)。,展望,近10 年來, 青蒿素合成生物學進展速度驚人, 通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)青蒿素前體已接近工業(yè)化規(guī)模, 但目前還不能實現(xiàn)青蒿素在微生物體內(nèi)的全合成. 國外擬采取“ 兩步法” 策略半合成青蒿素: 第一步是在微生物中獲得青蒿素前體, 第二步是利用化學方法將青蒿素前體轉(zhuǎn)變成青蒿素. 該方法一旦實施成功并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化, 必將帶