中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)Vasa、p68基因的克隆及其表達(dá)模式分析.pdf

1、中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)(Ovomermis sinensis)作為一種珍貴的昆蟲(chóng)天敵資源,在農(nóng)林和蔬菜等害蟲(chóng)生物防治方面具有很好的應(yīng)用前景。該類(lèi)索科線(xiàn)蟲(chóng)的性別分化較為特殊,其寄生期的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力決定線(xiàn)蟲(chóng)雌性性別的分化,即當(dāng)寄生期幼線(xiàn)蟲(chóng)在昆蟲(chóng)體內(nèi)的感染強(qiáng)度越低、每條線(xiàn)蟲(chóng)在血淋巴中獲得的營(yíng)養(yǎng)越多,越有可能發(fā)育成雌蟲(chóng),反之則為雄蟲(chóng)。近年來(lái),由于環(huán)境的破壞以及農(nóng)藥和化肥的濫用,外加索科線(xiàn)蟲(chóng)資源有限,這類(lèi)生防資源正面臨瀕臨消失的危險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者試圖利用

2、體外培養(yǎng)等方法解決現(xiàn)存問(wèn)題,但未獲成功,究其因?yàn)橹饕谟隗w外培養(yǎng)的線(xiàn)蟲(chóng)性別未能分化成熟,因而探討索科線(xiàn)蟲(chóng)性別分化的機(jī)理成為本研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。該領(lǐng)域研究的突破不僅具有非常重要的理論意義,而且具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,將為中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)大量體外培養(yǎng)獲得成功提供科學(xué)依據(jù),并促使其盡快用于生產(chǎn)實(shí)際。
　　 DEAD-box家族作為一個(gè)ATP依賴(lài)RNA解旋酶家族,包含有四個(gè)亞家族成員,對(duì)生物體的生殖發(fā)育、器官分化以及細(xì)胞增殖等多個(gè)方面都具有重要作

3、用。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作已成功獲得了這一家族的laf-1基因,并對(duì)其mRNA在中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其在中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)性腺發(fā)育的重要時(shí)期高水平表達(dá),而其他時(shí)期的表達(dá)量都相對(duì)較低,由此推測(cè)這一基因在線(xiàn)蟲(chóng)的生殖腺發(fā)育中發(fā)揮作用。此外,利用熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)不同組織部位laf-1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)這一基因的轉(zhuǎn)錄本在多處組織部位都有表達(dá),其功能可能較為廣泛。同時(shí)獲得的Tra-1基因,研究發(fā)現(xiàn)這一基因轉(zhuǎn)錄本在雌

4、性成蟲(chóng)中表達(dá)量明顯高于其他時(shí)期,推測(cè)其在雌蟲(chóng)生殖腺發(fā)育中具有重要作用。
　　 中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)存在復(fù)雜的性別分化機(jī)理,對(duì)分子機(jī)理的深入探討需要更多相關(guān)基因的研究支持。DEAD-box家族中的其他基因,如vasa、p68基因在從酵母到人類(lèi)很多物種中都得到了相關(guān)研究。其中vasa基因常作為生殖細(xì)胞的分子標(biāo)記用于原始生殖細(xì)胞的發(fā)生、遷移及發(fā)展等與生殖相關(guān)的研究；p68基因的轉(zhuǎn)錄本在很多物種的不同組織中都廣泛檢測(cè)到表達(dá)信號(hào),這一基因的表達(dá)對(duì)

5、生物體的生長(zhǎng)發(fā)育同樣起著非常重要的作用。而DEAD-box家族中的vasa、p68等基因在中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)是否存在,這些基因在索科線(xiàn)蟲(chóng)中是否也像其他物種一樣與生殖腺的發(fā)育相關(guān)聯(lián),這些基因在中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)的哪些組織部位表達(dá),表達(dá)是否具有特異性。為回答以上這些問(wèn)題,本文在已有工作基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下研究。
　　 一、采用RACE以及RT-PCR,獲得了中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)vasa基因,長(zhǎng)度為3053bp,其中開(kāi)放閱讀框(ORF)2439bp,編碼

6、813個(gè)氨基酸。RT-PCR結(jié)果顯示,vasa mRNA在中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)的精巢、卵巢中特異性表達(dá),而在其他部位,如頭、尾、體壁均未檢測(cè)到vasa的表達(dá)信號(hào)。vasa基因的轉(zhuǎn)錄本只在線(xiàn)蟲(chóng)的雌雄生殖腺中表達(dá)這一結(jié)果表明該基因與其生殖腺的功能相關(guān),在線(xiàn)蟲(chóng)的精巢、卵巢發(fā)育過(guò)程中起發(fā)揮作用。
　　 二、運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)vasa mRNA在線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育不同期的表達(dá)。結(jié)果表明,vasa mRNA在胚胎時(shí)期表達(dá)量較高,在精巢和卵巢增殖的初

7、期表達(dá)量逐漸增高,且在線(xiàn)蟲(chóng)從宿主體內(nèi)脫離第5天達(dá)最高值(P<0.05)。隨著性腺發(fā)育的逐漸成熟,其表達(dá)量減少。vasa mRNA早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)顯示,在中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)胚胎發(fā)育早期都可以檢測(cè)到vasa的轉(zhuǎn)錄信號(hào),且相對(duì)表達(dá)量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。推測(cè)其為母源性基因,母源因子在個(gè)體胚胎發(fā)育中起了至關(guān)重要的作用。在線(xiàn)蟲(chóng)性腺發(fā)生的過(guò)程中,這一基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)最為強(qiáng)烈,在從宿主體內(nèi)脫出之后,轉(zhuǎn)錄本顯示出先上升之后下降的表達(dá)趨勢(shì),推測(cè)va

8、sa與性腺的發(fā)生和分化相關(guān)聯(lián)。
　　 三、利用RACE技術(shù)獲得的中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)p68(Ddx5)基因全長(zhǎng)為2123bp,推測(cè)的氨基酸序列具有典型的DEXDc和HELICc結(jié)構(gòu)域。
　　 四、運(yùn)用RT-PCR方法,檢測(cè)p68在中華卵索線(xiàn)蟲(chóng)不同組織部位,結(jié)果顯示p68在線(xiàn)蟲(chóng)的不同部位都有表達(dá),并且精巢、卵巢中的表達(dá)量較其他部位更為強(qiáng)烈。據(jù)報(bào)道,在鼠的雄性生殖細(xì)胞中P68表達(dá)水平很高,金魚(yú)的p68基因在卵子及精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重