綿羊FGF5基因的克隆、表達及RNA干擾研究.pdf

1、養(yǎng)羊業(yè)是我國畜牧業(yè)的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，其中羊毛是重要的紡織原料，是養(yǎng)羊業(yè)中附加值較高的產(chǎn)品，對羊毛進行長度改變的研究是改善羊毛品質(zhì)和提高羊毛產(chǎn)量的重要手段。
　　 羊毛的生長發(fā)育主要是由細胞內(nèi)遺傳因子控制的，其品質(zhì)與產(chǎn)量主要是綿羊毛囊性狀所決定，毛囊發(fā)育過程中基因和蛋白表達的調(diào)控在很大程度上決定著羊毛的品質(zhì)和產(chǎn)量，同品種不同個體之間的產(chǎn)毛量與羊毛品質(zhì)具有明顯的差別，即使同一個體不同部位之間的產(chǎn)毛量與羊毛品質(zhì)也存在很大的差異，這種差異與基

2、因的差異表達有一定的內(nèi)在聯(lián)系。綿羊毛囊的發(fā)育是從合成特異性mRNA和蛋白質(zhì)開始的，根本的原因是核內(nèi)基因的啟動，基因的選擇表達，決定著毛囊的發(fā)育，利用與綿羊毛囊發(fā)育相關(guān)的基因，控制羊毛性狀的表達，最終可以改變羊毛原有的長度。因此研究與毛囊發(fā)育相關(guān)基因的表達，對調(diào)控羊毛性狀具有重要的意義。成纖維細胞生長因子5(fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5)是調(diào)節(jié)毛發(fā)長度的重要調(diào)控因子，已經(jīng)成為人們改善毛發(fā)長度的研究重點。本

3、研究通過PCR技術(shù)擴增綿羊FGF5基因CDS序列，利用生物信息學分析其編碼的蛋白信息和結(jié)構(gòu)特征；并進行組織特異性表達和原核表達及RNA干擾實驗研究。從而為闡明綿羊FGF5的功能尤其是在羊毛生長發(fā)育中的作用提供了理論和實驗基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)牛的FGF5基因cDNA保守區(qū)序列設(shè)計引物對綿羊FGF5基因cDNA進行擴增，將擴增片段進行克隆和測序，并與牛的FGF5基因序列進行同源性比較，確定擴增的片段為綿羊FGF5基因片段。利用生物信息

4、學分析程序和軟件，分析、預測FGF5蛋白的理化性質(zhì)、可溶性、翻譯后修飾位點、親(疏)水性、跨膜區(qū)、信號肽序列、蛋白細胞定位區(qū)域、二級結(jié)構(gòu)、抗原表位等，結(jié)果顯示該蛋白屬于可溶性和分泌型蛋白，具有免疫原性；與其他六種高等哺乳動物的序列同源性比較顯示，綿羊FGF5基因CDS序列與牛、人、小鼠、大鼠、犬和貓的對應(yīng)序列同源性高度保守，預測氨基酸序列同源性同樣具有高度保守性。
　　 采用RT-PCR方法，對綿羊皮膚、小腸、腎臟、心臟、肝臟、

5、脾臟、胰臟和肺進行了FGF5表達檢測，顯示皮膚組織中FGF5表達明顯高于其它實驗組織，證實FGF5基因在皮膚中的表達，對毛發(fā)的生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用，是調(diào)節(jié)毛發(fā)生長的重要基因。
　　 構(gòu)建該基因的原核表達載體，通過IPTG誘導其在大腸桿菌中融合表達，獲得一條55KDa的蛋白條帶；菌液進行超聲處理后，SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)沉淀在55 kDa處有條帶，上清的相應(yīng)位置沒有條帶，證明表達蛋白以包涵體的形式存在。
　　 根

6、據(jù)獲得的FGF5基因CDS序列設(shè)計RNA干擾片段，構(gòu)建具有干擾FGF5基因的RNAi載體，并通過綿羊成纖維細胞轉(zhuǎn)染實驗，篩選和鑒定含有目的基因的陽性細胞，最后通過熒光定量檢測RNAi干擾FGF5基因在細胞內(nèi)的蛋白表達水平。結(jié)果顯示我們設(shè)計的干擾綿羊FGF5 mRNA的3個不同區(qū)域中，Ⅰ、Ⅱ和III干擾載體轉(zhuǎn)染到細胞后，F(xiàn)GF5的表達量均顯著下降，其中，Ⅰ和III干擾載體干擾效果極為顯著，表明外源性H1啟動子能夠使siRNA干擾載體發(fā)揮作