茶葉中β-葡萄糖苷酶基因cDNA克隆與序列分析.pdf

1、該論文首次從茶葉中克隆出β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列,結(jié)果如下:依據(jù)茶樹葉片生化特點(diǎn),應(yīng)用Chomcznski一步法,并作了部分修改,從鮮葉中分離、提取總RNA.利用GenBank中已經(jīng)登錄的其它植物中該酶基因的保守序列,設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物,采用RT-PCR技術(shù),從茶樹擴(kuò)增出208bp的cDNA片段.將擴(kuò)增片段克隆到PMD18-T上進(jìn)行序列測(cè)定和分析,結(jié)果表明,此片段核苷酸序列與其他植物β-葡萄糖苷酶基因cDNA相應(yīng)序列有很好的同源性,

2、推斷該P(yáng)CR特異產(chǎn)物為茶樹β-葡萄糖苷酶基因cDNA片段.以此特異片段設(shè)計(jì)特異引物,采用RACE技術(shù)分別獲得β-葡萄糖苷酶cDNA3'端581bp和5'端895bp片段,后再依據(jù)上述兩段序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,擴(kuò)增出酶的全長(zhǎng)序列1475bp.經(jīng)Blast搜索表明:克隆所得堿基序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與已克隆出的小松樹、西葫蘆擬南芥等植物體內(nèi)β-葡萄糖苷酶基因的cDNA相應(yīng)序列有40﹪—60﹪的同源性,因此我們推斷擴(kuò)增所得到的序列為茶樹中β-葡萄

3、糖苷酶基因的cDNA.利用分子生物學(xué)軟件對(duì)氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和比較.結(jié)果表明,該序列的3'-端和5'端的非編碼序列長(zhǎng)度分別為189bp和233bp,開放閱讀框?yàn)?050bp,編碼350氨基酸,其轉(zhuǎn)運(yùn)肽長(zhǎng)度為82個(gè)氨基酸,成熟蛋白由257個(gè)氨基酸組成.經(jīng)Garnier法預(yù)測(cè),茶樹β-葡萄糖苷酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與其他植物相似,螺旋構(gòu)象14.33﹪、伸展構(gòu)象33.81﹪、折疊構(gòu)象25.43﹪.前體蛋白的分子量為40kDa,等電點(diǎn)(PI)