非洲豬瘟病毒P72基因單克隆抗體的制備及其重組桿狀病毒的構(gòu)建.pdf

1、非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)引起的豬的一種急性、烈性傳染病。臨床上以高熱、全身性出血和高死亡率為特征。該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，被OIE列為A類疫病。盡管我國(guó)尚無(wú)該病的傳入，卻時(shí)刻面臨傳入的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)展該病診斷方法和疫苗的儲(chǔ)備性研究，對(duì)于該病的防范具有重要意義。
　　 本研究利用原核表達(dá)的ASFV P72蛋白作為免疫原，制

2、備了P72蛋白的單克隆抗體，并構(gòu)建了P72基因的重組桿狀病毒，為非洲豬瘟的診斷方法和免疫預(yù)防等研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.P72基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備
　　 根據(jù)已發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)合成了ASFV P72基因，并將其克隆至原核表達(dá)載體pGEX-KG，得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pKG-P72。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)，P72蛋白

3、以可溶性形式在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)。以純化的P72蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，并通過(guò)細(xì)胞融合和間接ELISA方法篩選，獲得了5株能穩(wěn)定分泌針對(duì)P72蛋白的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E1、1F3、3F1、3D11、4F10，單抗亞類鑒定均屬于IgG2a。經(jīng)間接免疫熒光和Western Blot分析，獲得的5株單克隆抗體均能與P72原核和真核表達(dá)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 2.P72基因重組桿狀病毒的構(gòu)建<

4、br>　　 在構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-P72的基礎(chǔ)上，用BglⅡ+XbaⅠ雙酶切該質(zhì)粒，獲得CMV-P72表達(dá)框，并將其插入到轉(zhuǎn)移載體pFast-VSV-G中，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-G-P72。將該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選得到陽(yáng)性重組穿梭載體Bacmid-G-P72。將提取的重組Bacmid-G-P72 DNA轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BV-G-P72。將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)EPC細(xì)胞，