DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞生物學特性的影響及其調節(jié)睪酮合成機制的研究.pdf

1、脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）作為膽固醇代謝途徑中的重要中間產物，是機體中各種類固醇激素合成的重要前體。已有研究表明，DHEA在調節(jié)機體神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨質代謝、脂肪代謝等方面都發(fā)揮著重要作用。目前，大多數(shù)學者認為，DHEA主要是在外周靶組織/靶細胞中轉化為睪酮或雌二醇而發(fā)揮其特有的生物學功能。睪丸間質細胞分布于睪丸曲精小管間的疏松結締組織，其主要功能是合成和分泌睪酮，血漿睪酮的95％由睪丸間質

2、細胞分泌。本實驗室前期研究結果表明，外源性添加DHEA可促進不同生理期實驗大鼠血清中睪酮和雌二醇的分泌;在TM-3細胞（小鼠睪丸間質細胞系）上證實，DHEA處理可顯著抑制TM-3細胞的增殖，但卻能夠顯著增強TM-3細胞線粒體的功能;同時發(fā)現(xiàn)DHEA在TM-3細胞內主要向睪酮和雌二醇進行轉化，但其具體機制還不是很清楚。因此，本試驗在分離、純化和鑒定原代大鼠睪丸間質細胞的基礎之上，探討DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞增殖、細胞周期、線粒體膜電

3、位等生物學特性的影響;在證實DHEA影響原代大鼠睪丸間質細胞合成睪酮的基礎之上，重點從蛋白水平上檢測DHEA對類固醇激素合成過程中代謝關鍵酶表達的影響，繼而探討MAPK-ERK信號通路以及核轉錄因子CREB在調節(jié)原代大鼠睪丸間質細胞分泌睪酮中的作用。研究旨在揭示DHEA對特定靶細胞的生物學特性的影響，并從信號轉導通路的角度深入闡明其調節(jié)靶細胞合成類固醇激素的作用機制，以期為深入闡明DHEA的生物學功能提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　

4、1.DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞增殖特性的影響
　　本試驗以原代大鼠睪丸間質細胞為研究對象，探討DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞增殖以及細胞周期的影響。以含DHEA終濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育細胞24h后，分別采用倒置相差顯微鏡觀察和EdU法檢測DHEA對細胞增殖的影響;流式細胞術檢測不同濃度的DHEA處理6h、12h、24h和48h后，其對原代大鼠睪丸間質細胞周期的

5、影響;Real-timePCR檢測DHEA處理細胞24h后，細胞周期相關因子CyclinA、CDK2和CyclinBmRNA表達水平的變化。結果表明，倒置相差顯微鏡下可觀察到DHEA具有明顯抑制細胞增殖的作用;EdU法檢測進一步證實，50μmol/L和100μmol/LDHEA處理能夠抑制細胞增殖。與對照組相比，100μmol/LDHEA處理12h-48h，可顯著升高原代大鼠睪丸間質細胞中S期細胞的比例、降低G2/M期細胞比例（P＜0.

6、01）;50μmol/LDHEA處理48h，可顯著升高S期細胞的比例，降低G2/M期細胞比例(P＜0.01)。與對照組相比，100μmol/LDHEA處理可顯著降低原代大鼠睪丸間質細胞中CyclinA和CDK2mRNA的表達水平(P＜0.05)，但不同濃度的DHEA處理對CyclinBmRNA的表達均未達到統(tǒng)計學上的顯著影響(P＞0.05)。提示，DHEA處理可顯著抑制原代大鼠睪丸間質細胞增殖，其主要機制是DHEA可顯著抑制細胞周期相關

7、因子CyclinA和CDK2mRNA的表達水平，致使原代大鼠睪丸間質細胞滯留于S期，從而抑制細胞的增殖。
　　2.DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞線粒體功能的影響
　　本試驗以原代大鼠睪丸間質細胞為研究對象，探討DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞線粒體結構和功能的影響。用不同濃度DHEA處理原代大鼠睪丸間質細胞后，分別采用MTT法檢測細胞活力、透射電鏡觀察細胞線粒體形態(tài)及數(shù)目、流式細胞術檢測線粒體膜電位(△Ψm)、試劑盒法測定琥珀

8、酸脫氫酶(SDH)活性變化。結果顯示，與對照組相比，0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質細胞24h-48h，不同濃度的DHEA處理均可極顯著提高細胞的活力(P＜0.01)。1μmol/L、50μmol/L和100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質細胞48h，細胞線粒體形態(tài)和數(shù)目與對照組相比均無顯著性變化（P＞0.05）。與對照組相

9、比，不同濃度的DHEA處理均可降低原代大鼠睪丸間質細胞線粒體的膜電位;其中100μmol/LDHEA處理可極顯著降低細胞線粒體膜電位(P＜0.01)。1μmol/LDHEA處理對胞內琥珀酸脫氫酶(SDH)活性并無顯著影響（P＞0.05），但50μmol/L和100μmol/LDHEA處理可極顯著提高胞內SDH的活性（P＜0.01）。結果提示，DHEA處理可降低原代大鼠睪丸間質細胞線粒體的膜電位而使其通透性增加，同時其可通過提高SDH的活

10、性而增強自身氧化代謝水平，從而顯著提高原代大鼠睪丸間質細胞的活力。
　　3.DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞睪酮合成及關鍵酶表達的影響
　　本試驗以原代大鼠睪丸間質細胞為研究對象，探討外源性DHEA處理對原代大鼠睪丸間質細胞睪酮的合成及其合成途徑中關鍵酶表達的影響。以含DHEA終濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育大鼠睪丸間質細胞24h，以放射免疫分析法檢測睪酮含量，以Re

11、al-timePCR法檢測3β-羥基固醇脫氫酶(3β-HSD)、17β-羥基固醇脫氫酶(17β-HSD)mRNA表達水平的變化;繼而以100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質細胞0h、3h、12h、24h和48h，以Westernblot法檢測3β-HSD、17β-HSD和Aromatase蛋白表達的變化。試驗結果表明，DHEA能夠顯著促進原代大鼠睪丸間質細胞睪酮的合成，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應。50μmol/LDHEA處理可顯著提高

12、3β-HSDmRNA的表達水平，100μmol/LDHEA處理則可極顯著提高3β-HSDmRNA的表達水平(P＜0.01);同時，100μmol/LDHEA能夠顯著提高17β-HSDmRNA表達水平(P＜0.05)。Westernblot分析結果表明，與0h時相比較，100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質細胞12h-48h可顯著升高3β-HSD蛋白表達水平(P＜0.05)，100μmol/LDHEA處理48h能顯著降低芳香化酶的

13、蛋白表達水平(P＜0.05)，但DHEA處理不同時間對17β-HSD蛋白表達水平并無顯著性變化（P＞0.05）;與同時間點的對照組相比，100μmol/LDHEA處理細胞24h-48h可顯著提高3β-HSD和17β-HSD蛋白表達水平（P＜0.05），而100μmol/LDHEA處理細胞24h-48h則可顯著降低Aromatase蛋白表達水平(P＜0.05)。以上結果提示，DHEA處理可顯著上調原代大鼠睪丸間質細胞中3β-HSD和17β

14、-HSD的mRNA和蛋白表達、下調Aromatase蛋白表達，進而促進原代大鼠睪丸間質細胞中睪酮的合成。
　　4.DHEA調節(jié)原代大鼠睪丸間質細胞睪酮合成相關信號通路的研究
　　本試驗以原代大鼠睪丸間質細胞為研究對象，進一步探討DHEA對原代大鼠睪丸間質細胞睪酮合成相關信號通路的影響。結果顯示，不同濃度的DHEA處理，原代大鼠睪丸間質細胞內ERK1/2蛋白水平并未呈現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)，但50μmol/L和100μmo

15、l/LDHEA處理可極顯著提高p-ERK1/2蛋白水平(P＜0.01)。100mol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質細胞不同時間后，ERK1/2蛋白水平并未呈現(xiàn)明顯變化(P＞0.05);100μmol/LDHEA處理細胞30min和120min，可以極顯著提高p-ERK1/2蛋白水平（P＜0.01）;加入p-ERK1/2的抑制劑U0126處理后，DHEA對p-ERK1/2的這種促進作用可完全被逆轉。無論有、無抑制劑存在的條件下，1μmo

16、l/L、50μmol/L和100μmol/LDHEA處理均可顯著提高原代大鼠睪丸間質細胞睪酮的含量(P＜0.01)，且均呈現(xiàn)出明顯的劑量效應;同一劑量的DHEA處理條件下，抑制劑處理組睪酮的含量與無抑制處理組相比均明顯降低，且50μmol/L和100μmol/LDHEA處理時呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。與對照組相比，100μmol/LDHEA處理可顯著提高原代大鼠睪丸間質細胞3β-HSD蛋白和17β-HSD蛋白的表達水平(P＜0.05

17、)，抑制劑U0126預處理可顯著逆轉DHEA對睪丸間質細胞3β-HSD和17β-HSD蛋白表達水平的影響(P＜0.05);100μmol/LDHEA處理可極顯著降低原代大鼠睪丸間質細胞Aromatase蛋白的表達水平(P＜0.01)，但抑制劑U0126預處理并不能消除DHEA對Aromatase蛋白表達水平的抑制效應。100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質細胞30min，CREB蛋白水平并未呈現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）;但50μ