25300.黑曲霉α葡萄糖苷酶的基因克隆表達與定性

1、得的研究成果盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得江南大學或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。6乏簽名：盎麥壺日期：趁坦。!』。鏨關于論文使用授權的說明本學位論文作者完全了解江南大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定：江南大學有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查

2、閱和借閱，可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、；12編學位論文，并且本人電子文檔的內容和紙質論文的內容相一致。保密的學位論文在解密后也遵守此規(guī)定。簽名：隱壺2c2導師簽名：日期：—————』三_一／／／II／I／I／／#WII／／g。g聊HI／I／E／IIlIH3N／IH摘要a葡萄糖苷酶(EC32120)，又名aD葡萄糖苷水解酶，可以催化水解低聚糖類生成葡萄糖，其在自然界中廣泛分

3、布，性質各異。來源于黑曲霉(Aspergillusniger)的a葡萄糖苷酶不僅具有水解活性，還具有轉苷能力。當Anigera葡萄糖苷酶作用于麥芽糖時，能夠切割開麥芽糖的a1，4糖苷鍵，將游離出來的葡萄糖殘基以ft1，6形式轉移到其他糖底物上，形成具有非發(fā)酵性的功能性低聚糖——低聚異麥芽糖(簡稱IMOs，主要包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等)，因此在工業(yè)上廣泛應用于IMOs的生產。本實驗室前期的研究工作中，通過重疊PCR擴增得到4n／g

4、e，SGl36的0t葡萄糖苷酶cDNA，并在畢赤酵母(Pichapastoris)中表達，但是所獲得的重組酶生化活性較低。本研究以彳nigerCICIMF0620的總RNA為模板，通過RTPCR獲得a葡萄糖苷酶eDNA，并在只pastorisKM71中表達，同時對重組Ppastoris生產a葡萄糖苷酶的發(fā)酵工藝和重組酶的酶學性質進行研究。主要研究結果如下：(1)以AnigerCICIMF0620的總RNA為模板，通過RTPCR擴增得到全

5、長為2883bp的a葡萄糖苷酶eDNA。將該eDNA克隆到只pastoris表達載體pPIC9K上，BglII酶切線性化后電轉入戶pastoris菌株KM71，經(jīng)過MD、YPD／G418平板篩選，獲得重組菌株KM71／pPIC9Kagtu。搖瓶發(fā)酵條件下誘導120h，重組菌發(fā)酵上清液中的pNPG水解酶活為044U／mL。(2)考察基因工程茵KM71／pPIC9Kaglu的搖瓶發(fā)酵情況，確定適宜的發(fā)酵條件為：誘導階段初始菌濃OD600為5

6、0，誘導pH5，誘導溫度280C，每24h添加15％(v／v)醇，誘導表達周期120h，酶活可達到115U／mL，是原始野生菌產酶量的182倍。(3)在3L發(fā)酵罐上，通過優(yōu)化誘導起始菌濃和起始甲醇添加量，KM71／pPIC9Kagtu誘導96h后發(fā)酵上清液的pNPG水解酶活達351U／mL，蛋白含量為1759I_tg／mL。其酶活和蛋白含量分別是搖瓶水平的30和34倍。在30L罐上進行進一步試驗，終酶活達到512U／mL，表達量為現(xiàn)有報

7、道中的最高水平。(4)將重組酵母的發(fā)酵上清液經(jīng)過3kDa超濾膜濃縮、乙醇沉淀、疏水柱層析后得到純化的重組a一葡萄糖苷酶。重組0【葡萄糖苷酶在溶液中以二聚體形式存在。SDSPACE電泳表明，重組酶的分子量為145kDa，經(jīng)去糖基化酶EndoHf處理后，分子量減少至115kDa，證明重組酶在只pastoris表達系統(tǒng)中受到糖基化修飾。重組0【葡萄糖苷酶的最適溫度為600C，在500C具有良好的熱穩(wěn)定性；最適pH為45，pH穩(wěn)定范圍為pH30

8、70。在500C，pH45，以硝PG為底物，‰和‰觚分別為045mM和4348U／mg。大多數(shù)金屬對重組a葡萄糖苷酶的酶活性無明顯影響。(5)重組洳葡萄糖苷酶具有轉苷活性，可轉化麥芽糖生成IlViOs，轉苷能力與市售a葡萄糖苷酶相近。重組酶的最優(yōu)轉苷條件為：pH50的30％(w／v)麥芽糖溶液，加酶量O05U／g麥芽糖，600C反應20～24h。在最優(yōu)反應條件下，IMOs的產量可達18312g／L，轉化率為60％。本研究為重組Gt葡萄糖