Ⅱ型糖尿病BKS-db-db小鼠角膜病變評估及其相關(guān)信號通路的研究.pdf

1、目的:本研究采用24周齡的Ⅱ型糖尿病BKS-db/db小鼠及BKS-db/+對照小鼠，觀察其角膜病理改變，評估其角膜病變是否與臨床糖尿病角膜病變相吻合，并進(jìn)一步通過全基因組表達(dá)譜芯片比較糖尿病小鼠與對照組小鼠角膜組織基因的差異表達(dá)。
　　方法:選用24周齡的BKS-db/db小鼠及其對照小鼠，應(yīng)用裂隙燈、角膜共聚焦顯微鏡及角膜知覺儀等評估角膜上皮、神經(jīng)纖維分布、角膜知覺的變化。收取小鼠眼球或角膜，用于組織病理學(xué)檢查、免疫組化、全角

2、膜神經(jīng)染色、Western Blot、RT-PCR或基因表達(dá)譜芯片檢測。表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)經(jīng)GENESPRING12.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及差異表達(dá)篩選后，挑選出的差異基因用DAVID(the Database forAnnotation，Visualization，and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫中的GO(GeneOntology)和pathway數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，并進(jìn)一步選取差異表達(dá)基因行RT-PCR驗(yàn)證。

3、　　結(jié)果:與BKS-db/+小鼠比較，24周齡的Ⅱ型糖尿病BKS-db/db小鼠一致維持高血糖、高糖化血紅蛋白、多飲、多食、多尿等糖尿病基本體征;BKS-db/db小鼠角膜1％虎紅染色呈彌漫性片狀著色，熒光素鈉染色角膜呈點(diǎn)狀著色、上皮損傷愈合延遲，組織病理及角膜共聚焦顯微鏡顯示角膜上皮細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞凋亡染色顯示上皮細(xì)胞凋亡增加;全角膜神經(jīng)染色、角膜共聚焦顯微鏡及角膜知覺儀顯示角膜神經(jīng)形態(tài)異常、密度降低、角膜知覺減退;免疫組化及Wes

4、tern Blot提示BKS-db/db小鼠角膜中氧化亞硝酸鹽表達(dá)增多、MIP2表達(dá)增多及P物質(zhì)表達(dá)降低?；虮磉_(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，共有2423條差異表達(dá)基因（1125條上調(diào)，1298條下調(diào)），應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，GO-BP進(jìn)程中，發(fā)現(xiàn)上調(diào)占優(yōu)勢的基因主要富集于“Wnt受體信號通路”及“磷酸鹽代謝過程”，而下調(diào)占優(yōu)勢的基因主要富集于“DNA損傷修復(fù)”、“DNA重組”、“DNA代謝進(jìn)程”、“細(xì)胞分裂”、“細(xì)胞

5、周期”及“細(xì)胞增殖”等;在GO-CC中，發(fā)現(xiàn)上調(diào)占優(yōu)勢的基因主要富集于“神經(jīng)元突觸”，而下調(diào)占優(yōu)勢的基因主要富集于“細(xì)胞突觸”及“線粒體”;在Pathway信號通路中，發(fā)現(xiàn)上調(diào)占優(yōu)勢的基因主要富集于“Wnt信號通路”，而下調(diào)占優(yōu)勢的基因主要富集于“DNA重組”及“同源重組”。
　　結(jié)論:24周齡Ⅱ型糖尿病BKS-db/db小鼠一致維持糖尿病的基礎(chǔ)代謝體征，在其24周齡時(shí)眼部體征表現(xiàn)為角膜神經(jīng)纖維形態(tài)異常、密度降低及角膜知覺減退，角

6、膜上皮結(jié)構(gòu)、功能異常及角膜上皮損傷愈合延遲，24周齡的Ⅱ型糖尿病BKS-db/db小鼠表現(xiàn)出的角膜病變與臨床上Ⅱ型糖尿病患者所表現(xiàn)出的角膜癥狀相吻合，所以24周齡的Ⅱ型糖尿病BKS-db/db小鼠可以進(jìn)一步作為用來研究Ⅱ型糖尿病角膜病變的動物模型。在糖尿病性角膜病變中，表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析提示線粒體功能異常、Wnt信號通路被激活、DNA損傷修復(fù)能力下降、細(xì)胞增殖、分裂能力下降，能從基因水平合理的解釋糖尿病性角膜病變。此外，本研究發(fā)現(xiàn)氧化亞