水通道蛋白1在小鼠內(nèi)耳的超微結(jié)構(gòu)定位及功能探討.pdf

1、水通道蛋白(Aquaporin,AQP)的發(fā)現(xiàn)解決了生理學(xué)上一個(gè)長(zhǎng)期存在的關(guān)于生物膜水通透性的問(wèn)題，PeterAgre因此獲得2003年諾貝爾獎(jiǎng)。現(xiàn)認(rèn)為生物膜的水轉(zhuǎn)運(yùn)同時(shí)存在簡(jiǎn)單擴(kuò)散和通道介導(dǎo)兩種機(jī)制，水通道蛋白是介導(dǎo)水分子的順跨膜滲透壓梯度快速轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白家族，在多種類型細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)，現(xiàn)已從哺乳動(dòng)物克隆了至少11種蛋白亞型(AQP0-10)。 內(nèi)、外淋巴液間的水轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于調(diào)節(jié)內(nèi)耳液體的容量和維持離子濃度具有重要意義。內(nèi)淋巴液

2、離子組成的變化，特別是體積的增加(內(nèi)淋巴水腫)，將引起內(nèi)耳感覺(jué)功能的障礙，如梅尼埃病。目前為止在哺乳動(dòng)物內(nèi)耳已發(fā)現(xiàn)7種水通道蛋白亞型，其中AQP1在內(nèi)耳分布最為廣泛、表達(dá)量也較大。雖然在水通道各亞型中關(guān)于AQP1的基礎(chǔ)、臨床研究最為深入，但AQP1在內(nèi)耳的精確定位及其功能仍不清楚，所以本研究首先選擇研究AQP1的免疫組織化學(xué)定位、Westernblot半定量分析及超微細(xì)胞化學(xué)定位，并進(jìn)一步分析AQP1在內(nèi)耳的功能。 本研究首先應(yīng)

3、用冰凍切片免疫熒光染色法和兩步法免疫組化(DAB染色)研究AQP1在小鼠內(nèi)耳的組織分布情況，觀察到AQP1表達(dá)在小鼠螺旋韌帶緊靠骨壁的Ⅲ型纖維細(xì)胞區(qū)域、鼓階和前庭階的間皮細(xì)胞及內(nèi)淋巴囊上皮下結(jié)締組織等處。通過(guò)Westernblot進(jìn)一步證實(shí)AQP1在小鼠內(nèi)耳耳蝸、前庭和內(nèi)淋巴囊的表達(dá)，并半定量的分析出耳蝸內(nèi)AQP1的表達(dá)量較在內(nèi)淋巴囊的表達(dá)量多。 為進(jìn)一步分析AQP1在小鼠內(nèi)耳的功能，本研究通過(guò)免疫電鏡觀察了AQP1在小鼠內(nèi)耳組

4、織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)定位。在此之前，本研究為兼顧細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和抗原活性，通過(guò)配比預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了免疫電鏡實(shí)驗(yàn)時(shí)的最佳戊二醛和第一抗體濃度。研究結(jié)果顯示：AQP1同時(shí)存在于螺旋韌帶Ⅲ型纖維細(xì)胞靠近骨性膠原一側(cè)的細(xì)胞膜和靠近腔面一側(cè)的細(xì)胞膜上，特別在其豐富的細(xì)胞突起上有大量的表達(dá)，富含AQP1的細(xì)胞突起伸入至疏松的結(jié)締組織中；螺旋緣的纖維細(xì)胞及細(xì)胞突起的胞膜上也有少量的AQP1表達(dá)；AQP1在內(nèi)淋巴囊上皮下結(jié)締組織層的纖維細(xì)胞膜上有表達(dá)，在細(xì)胞突起

5、的胞膜上有大量膠體金顆粒的標(biāo)記，而細(xì)胞體的胞膜上標(biāo)記相對(duì)較少。根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)AQP1可能在以下方面起作用： 參與鼓階和前庭階之間外淋巴液交換及膜蝸管結(jié)構(gòu)的維持：一般認(rèn)為鼓階和前庭階之間外淋巴液只在頂回以蝸孔相通，本研究據(jù)以上結(jié)果提出外淋巴液交換可能存在另一途徑——表達(dá)AQP1的Ⅲ型纖維細(xì)胞可能是鼓階和前庭階之間外淋巴液交換的中介。通過(guò)這一外淋巴液交換的新途徑可迅速協(xié)調(diào)鼓階和前庭階之間外淋巴液體滲透壓的變化，使兩階中液體的滲透壓

6、迅速達(dá)到平衡，從而維持膜蝸管的正常形態(tài)及其結(jié)構(gòu)功能。 參與耳蝸鉀離子循環(huán)：耳蝸鉀離子循環(huán)可能存在的三個(gè)途徑包括外側(cè)循環(huán)途徑、外淋巴途徑和中間途徑。在鉀離子循環(huán)中，螺旋韌帶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型纖維細(xì)胞處于外側(cè)循環(huán)途徑和外淋巴途徑的中心位置，其結(jié)構(gòu)和功能的完整對(duì)維持耳蝸鉀離子穩(wěn)態(tài)和正常內(nèi)淋巴電位有重要作用。而AQP1表達(dá)在與上述細(xì)胞相鄰的Ⅲ型纖維細(xì)胞膜上，推測(cè)其可迅速的彌補(bǔ)由于K+流動(dòng)引起的滲透壓改變，間接參與鉀離子循環(huán)。螺旋緣的纖維細(xì)

7、胞位于中間途徑上，其上表達(dá)的少量AQP1可能也起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。AQP1與其它水通道蛋白亞型之間具有互補(bǔ)或協(xié)同作用，共同維持內(nèi)耳液體的平衡。 與內(nèi)淋巴囊的吸收功能有關(guān)：由于內(nèi)淋巴囊近端部上皮細(xì)胞間有縫隙，被認(rèn)為是內(nèi)淋巴囊吸收水的主要部位；而遠(yuǎn)端部和中間部上皮細(xì)胞間存在大量細(xì)胞連接，相對(duì)沒(méi)有縫隙存在。因此推測(cè)水可能經(jīng)內(nèi)淋巴囊近端部上皮細(xì)胞間的縫隙進(jìn)入上皮下網(wǎng)狀結(jié)締組織，并在中間部及遠(yuǎn)端部的上皮下結(jié)締組織中相對(duì)自由的流動(dòng)，最終可