小鼠長(zhǎng)髓襻腎單位細(xì)段空間走行及超微結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、目的：
　　根據(jù)髓襻的襻曲在髓質(zhì)的位置差異，將腎單位分為短髓襻腎單位(SLN)和長(zhǎng)髓襻腎單位(LLN)。其中，LLN的髓襻一直伸入內(nèi)髓，部分可達(dá)到腎乳頭，被認(rèn)為參與腎髓質(zhì)高滲梯度的形成，產(chǎn)生濃縮尿，而SLN的髓襻伸入到外髓內(nèi)帶不同水平。腎髓質(zhì)高滲梯度的產(chǎn)生與腎髓質(zhì)的各小管走行、上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能有著密切關(guān)系。以往對(duì)多種屬動(dòng)物及人腎組織斷層研究表明，小鼠LLN細(xì)段并不是簡(jiǎn)單的單層扁平上皮，其超微結(jié)構(gòu)復(fù)雜且存在節(jié)段性變化。根據(jù)

2、其細(xì)胞游離面的微絨毛形狀及數(shù)量、側(cè)面突起的復(fù)雜性及緊密連接數(shù)量、基底面質(zhì)膜內(nèi)褶及線(xiàn)粒體分布的差異將其分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三種類(lèi)型。其中，Ⅱ型上皮構(gòu)成LLN細(xì)段降支的上段，Ⅲ、Ⅳ型上皮依次構(gòu)成LLN細(xì)段降支的下段及細(xì)段升支。
　　然而，這種傳統(tǒng)的局域斷層組織學(xué)研究手段限制了對(duì)此區(qū)域內(nèi)各個(gè)小管及血管來(lái)源及毗鄰關(guān)系的判斷，如髓襻的長(zhǎng)短、血管的升降支、髓襻與集合管的辨別等，從而影響對(duì)其功能的整體分析。本研究借助計(jì)算機(jī)圖像處理及程序追蹤技術(shù)，并結(jié)

3、合經(jīng)典的生物樣本光電鏡切片制備技術(shù)，提高了腎髓質(zhì)各種管腔走行及毗鄰關(guān)系研究的效率，并進(jìn)而在數(shù)字追蹤腎單位、集合管及血管的基礎(chǔ)上，精準(zhǔn)研究細(xì)段在特定水平的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，結(jié)合其上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，分析其在髓質(zhì)可能的生理功能或意義。
　　方法：
　　1、腎組織連續(xù)半薄切片的制備
　　三只體重為25g的C57BL/6J小鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈逆流固定后取腎。其固定液為0.1 mol/L的二甲砷酸鈉緩沖液配制的1％戊二醛，PH值為7.4。腎臟在

4、同種固定液續(xù)固定24小時(shí)后垂直于腎長(zhǎng)軸并經(jīng)腎乳頭取組織塊，鋨酸后固定2h，梯度酒精丙酮脫水，樹(shù)脂812包埋。采用超薄切片機(jī)及鉆石刀從腎被膜到腎乳頭得到2000張左右連續(xù)的2.5μm厚的半薄切片，再通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色顯示其微細(xì)結(jié)構(gòu)。
　　2、腎組織顯維圖像攝取及配準(zhǔn)
　　采用顯微圖像攝取系統(tǒng)“Olympus AX70光學(xué)顯微鏡-電動(dòng)載物臺(tái)-Olympus DP50數(shù)碼相機(jī)-AnalySIS分析軟件”，對(duì)每張切片進(jìn)行拍照。采集的連

5、續(xù)彩色數(shù)字顯微圖像被保存為T(mén)IFF格式。圖像配準(zhǔn)過(guò)程在計(jì)算機(jī)Windows操作平臺(tái)上進(jìn)行。通過(guò)比較相鄰兩幅圖像內(nèi)生理對(duì)應(yīng)點(diǎn)的像素灰度值的相似性，確定每個(gè)圖像沿x軸和y軸平移的距離，以及旋轉(zhuǎn)角度。為達(dá)到生理空間的一致，首先計(jì)算相鄰兩幅圖的平移距離和旋轉(zhuǎn)角度的相對(duì)變換值，再求得其相對(duì)變換值的相加函數(shù)，從而得到系列圖像中的每幅圖的絕對(duì)變換值，實(shí)現(xiàn)圖像配準(zhǔn)。
　　3、LLN細(xì)段數(shù)字追蹤，三維重建并可視化
　　追蹤過(guò)程是通過(guò)運(yùn)行C語(yǔ)言

6、編寫(xiě)的程序，在計(jì)算機(jī)Linux系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)的。具體過(guò)程是，在連續(xù)的顯微圖像上，從腎小體尿極起始，沿腎小管至集合管，鼠標(biāo)點(diǎn)擊管腔斷面，標(biāo)記為綠色阿拉伯?dāng)?shù)字，追蹤結(jié)束后，將標(biāo)記此條小管的綠色阿拉伯?dāng)?shù)字變?yōu)榧t色，以區(qū)別正在追蹤的腎小管（綠色）。圖像上具有相同阿拉伯?dāng)?shù)字的小管來(lái)自于同一個(gè)腎單位。追蹤過(guò)程自動(dòng)生成一個(gè)數(shù)據(jù)文件(data.dat)，記錄追蹤小管走行的空間坐標(biāo)。此外，將追蹤過(guò)程中識(shí)別的小管節(jié)段移行處的坐標(biāo)手工輸入另一數(shù)據(jù)文件中(segm

7、entdata.dat)，將兩個(gè)坐標(biāo)數(shù)據(jù)文件輸入三維重建可視化軟件中，顯示腎小管的全程走行，且不同節(jié)段賦予不同顏色。
　　4、LLN細(xì)段電鏡亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析
　　在三維重建LLN腎單位基礎(chǔ)上，在小鼠腎髓質(zhì)外髓區(qū)域范圍內(nèi)，從原始連續(xù)切片中每隔30μm選取要觀(guān)察細(xì)段相對(duì)應(yīng)的切片，采用樹(shù)脂812再包埋，鉆石刀獲取一系列超薄切片（50nm厚）。經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色后在透射電鏡下觀(guān)察，確定髓襻細(xì)段的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行分型。
　

8、　5、LLN細(xì)段各型及各亞型長(zhǎng)度測(cè)量
　　基于追蹤過(guò)程自動(dòng)生成的坐標(biāo)數(shù)據(jù)集，LLN細(xì)段不同類(lèi)型及同一類(lèi)型不同亞型節(jié)段的長(zhǎng)度測(cè)量得以實(shí)現(xiàn)。長(zhǎng)度的測(cè)量運(yùn)用歐幾里德算法: n∑i=2√(xi-xi-1)2+（yi-yi-1）2+(zi-zi-1)2
　　結(jié)果：
　　1、LLN細(xì)段由髓襻降支粗段（近端小管直部）的單層立方上皮在外髓外帶與內(nèi)帶交界處移行為單層扁平上皮而成。其走行一直伴隨在其最終注入的集合管左右。在外髓內(nèi)帶，細(xì)段降

9、支還與髓襻升支粗段相伴行，而在內(nèi)髓，則與其返折回來(lái)的髓襻細(xì)段升支相伴行。有趣的是，細(xì)段總有一側(cè)上皮與毛細(xì)血管網(wǎng)相毗鄰。此外，細(xì)段降支起始部分（外髓內(nèi)帶的外側(cè)分）高度盤(pán)曲，使此段的長(zhǎng)度是空間直線(xiàn)距離的2倍;與之伴行的集合管及髓襻升支粗段也在此區(qū)域彎曲走行;此后便直行進(jìn)入內(nèi)髓，在內(nèi)髓不同水平構(gòu)成襻曲。
　　2、電鏡下觀(guān)察:與傳統(tǒng)方法研究結(jié)果一致的是，髓襻細(xì)段從降支起始到升支細(xì)段，再到與髓襻升支粗段相移行部，依次由Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型上皮構(gòu)

10、成。但采用本研究方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型上皮在走行過(guò)程中呈現(xiàn)出規(guī)律性的節(jié)段改變，故而又被分為a、b、c三個(gè)亞型。與傳統(tǒng)研究手段更顯優(yōu)勢(shì)的是，在三維追蹤基礎(chǔ)上，所有亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分型及亞型都有精準(zhǔn)的節(jié)段和長(zhǎng)度。
　　簡(jiǎn)言之，髓襻降支細(xì)段游離面的微絨毛由Ⅱ型上皮的短而鈍，變成Ⅲ型上皮的細(xì)而長(zhǎng)，到Ⅳ型上皮時(shí)消失;側(cè)突由Ⅱ型上皮的多而復(fù)雜、指狀交錯(cuò)，并構(gòu)成細(xì)胞間迷路，側(cè)面頂端緊密連接清晰可見(jiàn)，到Ⅲ型上皮時(shí)的少而簡(jiǎn)單，再到Ⅳ型上皮的復(fù)雜結(jié)構(gòu);基底面質(zhì)

11、膜內(nèi)褶也由Ⅱ型的多而粗大，且期間可見(jiàn)大量排列的線(xiàn)粒體，到Ⅲ型的細(xì)指狀突起，少有線(xiàn)粒體位于期間，再到Ⅳ型的線(xiàn)粒體分布于其基側(cè)突中。Ⅱa型上皮分布在起始端彎曲部分，比其它部分要厚而且表現(xiàn)出明顯的極性，隨即，其厚度及復(fù)雜性降低并逐漸移行為Ⅱb和Ⅱc型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單層扁平上皮。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型上皮起始于細(xì)段襻曲前幾十到幾百微米不等的降支。
　　結(jié)論：
　　小鼠LLN細(xì)段走行有明確的規(guī)律性的區(qū)域特征及毗鄰關(guān)系，相一致的是，其區(qū)域性