苦皮藤內(nèi)生真菌農(nóng)用活性成分的研究.pdf

1、該論文以一株編號(hào)為2B的苦皮藤內(nèi)生真菌為出發(fā)菌株,應(yīng)用形態(tài)學(xué)的方法鑒定了其種屬地位;研究了其代謝產(chǎn)物的農(nóng)用生物活性,并對(duì)目標(biāo)活性物質(zhì)進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)解析,采取誘變育種手段選育了高產(chǎn)菌株,并對(duì)高產(chǎn)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化.通過試驗(yàn)結(jié)果的分析和討論,取得了以下結(jié)論:1、根據(jù)真菌的分類及鑒定方法,用光學(xué)顯微鏡觀察2B菌株氣生菌絲、大型分生孢子、小型分生孢子及菌落性狀,對(duì)比相關(guān)分類系統(tǒng),將2B菌株鑒定為層出鐮刀菌(Fusarium prolife

2、ratum).2、在對(duì)2B菌株發(fā)酵產(chǎn)物生物活性研究中,發(fā)現(xiàn)2B菌株發(fā)酵產(chǎn)物甲醇提取物有明顯的抑菌活性,在1000μg·mL<'-1>濃度下對(duì)番茄早疫病菌(Alternaria solani)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、小麥根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)4種供試菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制率均大于80%;在盆栽試驗(yàn)中,對(duì)黃瓜霜霉

3、病菌(Pseudoperonospora cubensis)的治療和保護(hù)作用均在70%以上.3、采用常壓柱層析、HPLC制備等方法,在生物活性追蹤指引下,從2B菌株發(fā)酵產(chǎn)物分離出4個(gè)化合物2B-1,2B-2,2B-3,2B-4.經(jīng)波譜技術(shù)(IR,<'1>H NMR,<'13>C NMR,COSY,MS),結(jié)合化學(xué)檢驗(yàn)方法,并與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比,將分離得到的化合物分別鑒定為enniatin B,enniatin B<,1>,enniatin

4、A<,1>,ergosterin.化合物2B-1,2B-2,2B-3在100μg·mL<'-1>濃度下,對(duì)玉米大斑病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為68.18%,87.49%,90.91%.4、建立了恩鐮孢菌素(enniatins)的HPLC檢測(cè)方法.檢測(cè)條件為色譜柱(C18柱,0.9×30cm,10μm);流動(dòng)相(V:V)甲醇:水(88:12);流速1mL·min<'-1>;檢測(cè)波長(zhǎng)UV229nm;室溫下5μL進(jìn)樣,該方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<

5、1%,平均回收率在98%以上.5采用紫外線(UV),甲基磺酸乙酯(EMS),超聲波+UV+EMS 3種誘變方式進(jìn)行復(fù)合誘變,同時(shí)結(jié)合形態(tài)變異與產(chǎn)量之間的相關(guān)關(guān)系,挑選形態(tài)差異明顯的單菌落,然后通過搖瓶發(fā)酵篩選enniatins高產(chǎn)菌株,通過3輪誘變篩選大幅度提高了菌種的生產(chǎn)能力,最后得到的突變株UE152代謝enniatinns總產(chǎn)量為59.72mg·100mL<'-1>,是出發(fā)菌株搖瓶效價(jià)2.9倍,且該突變株的高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定.6、通

6、過單因子試驗(yàn)和多因子正交試驗(yàn)篩選獲得UE152菌株最佳的搖瓶培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件為葡萄糖2%、土豆20%、蛋白胨0.5%、NH<,4>Cl0.3%、MgS0<,4>0.1%和CaCO<,3>0.1%,培養(yǎng)溫度26℃,接種量10塊菌餅(每50mL發(fā)酵液),初始pH值為6.0~7.0,裝液量50mL(每250mL三角瓶),轉(zhuǎn)速160rpm,發(fā)酵時(shí)間120h.在上述實(shí)驗(yàn)條件下enniatinns總產(chǎn)量可達(dá)88.68mg·100mL<'-1>,