SRT1720激活SIRT1抑制軟骨細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、【研究目的】
　　骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱退行性關節(jié)炎，是一種由于關節(jié)軟骨退行性病變引起的關節(jié)疼痛和關節(jié)功能障礙（包括關節(jié)畸形）的中老年常見疾病。曾經(jīng)一度認為關節(jié)軟骨的改變是骨關節(jié)炎主要的病變，但現(xiàn)在普遍認為，所有關節(jié)結(jié)構(gòu)包括軟骨鈣化區(qū)、軟骨下骨、骨小梁、關節(jié)囊等都受到影響。然而，OA的具體發(fā)病機制現(xiàn)在還沒有完全明確，且其治療也是一個棘手的問題。臨床治療方法很多，但迄今還沒有一種治療方法能有效阻斷骨關節(jié)

2、炎的病理進程，而對于后期治療采用的關節(jié)置換術存在費用大、風險性高、假體容易出現(xiàn)問題等。
　　目前在OA的基因治療方面，國際上還處于動物實驗階段，但是關節(jié)軟骨細胞凋亡在OA軟骨退變發(fā)生發(fā)展中的作用如何，以及藥物調(diào)控某個或多個基因治療OA的療效如何，是一個值得深入研究的課題。由于骨關節(jié)炎是一種衰老相關性疾病，同時SIRT1基因在抗衰老方面具有的重要作用已引起人們高度關注，因此本項目以SIRT1作為靶點研究其對關節(jié)軟骨細胞凋亡調(diào)控機制。

3、通過采用新型藥物SRT1720啟動SIRT1，研究對軟骨細胞凋亡的調(diào)控作用，進一步闡明OA發(fā)生發(fā)展中SIRT1的作用，為防治OA提供新的靶位；與此同時研究新型藥物SRT1720對軟骨細胞凋亡的影響，為藥物防治OA開辟一條新的途徑。
　　【實驗方法】
　　一、軟骨細胞分離培養(yǎng)
　　新西蘭大白兔（2月齡）麻醉，取其雙膝股骨髁及脛骨平臺軟骨，放入盛有DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。PBS沖洗數(shù)次后，剪切軟骨至1mm3大小的碎塊

4、。加入酶消化，然后離心，將分離的細胞均勻分布于培養(yǎng)基中。
　　二、分組加入藥物后誘導軟骨細胞凋亡
　　1．按不同SRT1720濃度分組：
　　2．硝普鈉(SNP)誘導軟骨細胞凋亡：1h后在培養(yǎng)體系中分別加入0.25mmol／L SNP，孵育12h。
　　三、相關實驗檢測
　　1．MTT法檢測各組軟骨細胞活性及增殖
　　2．DAPI染色和流式細胞術檢測各組細胞凋亡
　　3．western-blot

5、技術檢測各組細胞Sirt1、p53、NF-κB、bax、PGC-1α的表達
　　4．RT-PCR法檢測各組細胞Sirt1、Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖mRNA的表達
　　【實驗結(jié)果】
　　1．MTT法示：隨著SRT1720濃度增高，細胞活性依次增強。
　　2．DAPI染色示：SRT1720干預組的軟骨細胞核形完整、染色質(zhì)均勻；而對照組軟骨細胞可見核破裂形成碎片，核解體。
　　3．流式細胞術示：隨著SRT172

6、0濃度增高，細胞凋亡率依次降低。
　　4．western-blot示：隨著SRT1720濃度增高，細胞Sirt1、PGC-1α的表達依次增高，而p53、NF-κB、bax的表達依次降低。
　　5．RT-PCR示：隨著SRT1720濃度增高，細胞Sirt1、Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖mRNA的表達依次增高。
　　【結(jié)論】
　　1．SRT1720能啟動Sirt1基因使其對關節(jié)軟骨細胞發(fā)揮保護作用,抑制軟骨細胞凋亡。這