松鼠葡萄球菌mecA和金黃色葡萄球菌mecA在松鼠葡萄球菌耐藥機(jī)制及細(xì)胞壁合成中的作用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院內(nèi)獲得性感染和社區(qū)獲得性感染的重要致病菌之一。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素曾經(jīng)是治療金黃色葡萄球菌感染的有效武器，但隨著耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus attreus，MRSA)分離率的逐漸增加，金黃色葡萄球菌引起的感染成為臨床上非常棘手的問(wèn)題。耐藥的主要決定基因?yàn)?mecA。mecA編碼的青霉素結(jié)合蛋白2A(penicillin-bindingprot

2、ein 2A，PBP2A) 對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素親和力很低，當(dāng)固有的PBP被β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素飽和時(shí)，PBP2A可替代這些PBPs的轉(zhuǎn)肽功能催化細(xì)胞壁合成。mecA基因并非金黃色葡萄球菌的固有基因，而是一外源基因，其來(lái)源有很多假設(shè)，目前認(rèn)為是從松鼠葡萄球菌中獲得。大多數(shù)松鼠葡萄球菌的mecA并不提供抗藥性，但把活化的松鼠葡萄球菌mecA引入到敏感的金黃色葡萄球菌可使后者的抗藥性大大增加，松鼠葡萄球菌的mecA基因產(chǎn)物能夠利用金黃色葡萄球

3、菌的細(xì)胞壁前體合成金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁。最近，我們分離到了既含有松鼠葡萄球菌的mecA又含有金黃色葡萄球菌的mecA的松鼠葡萄球菌K3，K3為黃色菌落，在沒(méi)有抗生素存在時(shí)能自發(fā)分化為K3y(黃色菌落)和K3w (白色菌落)。前者表型和基因型與親代菌完全相同，后者僅含有松鼠葡萄球菌mecA而丟失了金黃色葡萄球菌的mecA。本論文將針對(duì)這兩個(gè)mecA基因在松鼠葡萄球菌的耐藥性及細(xì)胞壁合成中的作用進(jìn)行研究。 目的：進(jìn)一步研究松鼠葡萄

4、球菌的生物學(xué)特征和基因特征以期更深入的理解金黃色葡萄球菌耐藥性基因mecA來(lái)源以及MRSA菌株的耐藥機(jī)制：同時(shí)，認(rèn)識(shí)臨床上分離率日益增加的松鼠葡萄球菌的耐藥機(jī)制。 方法：通過(guò)抗生素壓力選擇出松鼠葡萄球菌K3的高度均一耐藥株；應(yīng)用E-test和PAP 試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)松鼠葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥性；PCR擴(kuò)增兩個(gè)mecA基因并制備DNA探針；多重PCR 用于菌株K3和K8的SCCmec 分型；應(yīng)用 Northem blot 和 West

5、ern blot分別檢測(cè)兩個(gè)mecA基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)；通過(guò)克隆和測(cè)序排布出敏感菌 K1 及耐藥菌K3 orfX 區(qū)的基因分布，與GenBank中的同源序列進(jìn)行比較并分析其特征；Sma I消化染色體DNA后，脈沖場(chǎng)電泳分離消化產(chǎn)物，Southem blot檢測(cè)orfX和mecA在染色體上的位置關(guān)系；分離、純化細(xì)菌膜蛋白后應(yīng)用PBP assay鑒定出松鼠葡萄球菌的青霉素結(jié)合蛋白圖譜以及各個(gè)PBPs對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的親和

6、力；分離、純化細(xì)胞壁，高壓液相法分析細(xì)胞壁成分。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)抗生素選擇壓力，篩選出 K3 的 homo<'*> 衍生菌 K3HO，K3HW。K3HWO。K3 對(duì)苯唑西林呈異質(zhì)性耐藥，K3 homo<'*> 衍生菌對(duì)苯唑西林高度均一耐藥，MIC>400μg/ml。在抗生素存在的情況下，K3自發(fā)分化為K3w和K3y的現(xiàn)象被抑制，分化出的黃，白菌落均含有松鼠葡萄球菌mecA和金黃色葡萄球菌mecA。同時(shí)，金黃色葡萄球菌的mecA被大量

7、誘導(dǎo)，但Northem blot檢測(cè)不到松鼠葡萄球菌mecA的表達(dá)。K3 homo<'*>衍生菌的金黃色葡萄球菌mecA表達(dá)輕微提高，但也未能檢測(cè)到松鼠葡萄球菌mecA在RNA水平的表達(dá)。K3和K8分別為SCCmec ⅢB和SCCmec ⅢA型，SCCmec準(zhǔn)確的插入到orfX區(qū)。K1和K3 orfX區(qū)的基因排布和表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌相似而和金黃色葡萄球菌差異較大。orfX和mecA基因在染色體上的位置隨菌株不同而不同。鑒定了6種

8、PBPs，其中PBP4 即為松鼠葡萄球菌mecA的表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)苯唑西林呈低親和力。PBP6在苯唑西林耐藥性方面可能發(fā)揮了重要作用。苯唑西林耐藥菌細(xì)胞壁交聯(lián)率高于敏感菌，但交聯(lián)率的高低和菌株的MIC值并不呈線(xiàn)形關(guān)系。在抗生素壓力下，金黃色葡萄球菌的mecA產(chǎn)物能利用松鼠葡萄球菌細(xì)胞壁合成前體合成松鼠葡萄球菌的細(xì)胞壁。 結(jié)論：在兩個(gè)mecA共存的松鼠葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌mecA和抗藥性直接相關(guān)，但也不能排除松鼠葡萄球菌mecA