腸道病毒71型H6株在Vero細(xì)胞上的傳代適應(yīng).pdf

1、腸道病毒71型(EV71)感染可引起手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、腦干腦炎、肺水腫等多種疾病。近年來，引起嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病的EV71大爆發(fā)在亞太地區(qū)頻繁出現(xiàn)，包括1997年的馬來西亞、1999年的澳大利亞、2000年的新加坡、1997年和2000年的日本，1998年的中國臺(tái)灣，及2008年和2009年的中國大陸等。在過去的10年里，由EV71引起的神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥不斷增多。隨著EV71在全世界范圍的蔓延，如何有效

2、治療和控制該病毒的傳播一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。由于目前尚無針對EV71的特效藥和疫苗，因此，研發(fā)一種能有效控制EV71流行的疫苗已勢在必行。本課題研究了EV71H6株在Vero細(xì)胞中的傳代適應(yīng)，為以后制備疫苗提供大量抗原。
　　 本課題以EV71H6株病毒為研究材料，建立其在Vero細(xì)胞上的適應(yīng)株。首先將EV71H6株病毒在RD細(xì)胞上進(jìn)行分離，并在Vero細(xì)胞上通過蝕斑篩選和適應(yīng)性傳代，然后開展生物學(xué)、免疫學(xué)及理化學(xué)特性的研究。<

3、br>　　 用常規(guī)方法處理來自臨床確診為手足口病患兒的糞便標(biāo)本。將標(biāo)本接種于RD細(xì)胞，盲傳3代后即可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，然后在Vero細(xì)胞上進(jìn)行蝕斑篩選和連續(xù)傳代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，各代病毒蝕斑直徑大小沒有變化，傳至第5代時(shí)，CPE明顯增多，病毒滴度從4.75LogCCID5o/ml提高到8.13LogCCID50/ml，繼續(xù)傳代，病毒滴度穩(wěn)定在8.00LogCCID50/ml以上。EV71H6株病毒的最佳培養(yǎng)條件試驗(yàn)表明，制備毒種的適宜

4、MOI為0.01；在96小時(shí)左右收獲的病毒滴度最高；在-80℃環(huán)境下能夠穩(wěn)定保存。理化學(xué)研究試驗(yàn)結(jié)果表明，EV71核酸類型為RNA，不具有耐熱性，但可耐受乙醚、酸的作用。經(jīng)傳代后的穩(wěn)定性試驗(yàn)研究表明，EV71H6適應(yīng)株可被特異抗EV71血清中和，證明該病毒確為EV71型。用EV71H6適應(yīng)株病毒免疫家兔，以RD細(xì)胞為基質(zhì)進(jìn)行中和試驗(yàn)，其免疫原性研究結(jié)果顯示，中和抗體效價(jià)有了逐步提高，最高可達(dá)1:1024，顯示了良好的免疫原性。