TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR檢測輪狀病毒G4型VP7基因方法的建立.pdf

1、目的：建立基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測與定量輪狀病毒G4型VP7基因的方法。
　　 方法：輪狀病毒(Rotavirus，RV)是5歲以下兒童重癥腹瀉最主要的病原體，其感染引起的死亡占兒童死亡數(shù)的5％，其中90％發(fā)生在發(fā)展中國家。WHO推薦所有國家的免疫程序中應(yīng)當(dāng)包含輪狀病毒疫苗，以預(yù)防輪狀病毒感染。實(shí)時(shí)定量PCR(Polymerase chain reaction)可連續(xù)收集一只或多只PCR管中每個(gè)循環(huán)的熒光信

2、號(hào)，該信號(hào)與模板的拷貝數(shù)相關(guān)。一個(gè)完美的定量PCR其斜率為3.32，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增效率為100％，截距在33到37個(gè)循環(huán)之間且R2為1.00。本試驗(yàn)?zāi)康氖墙⒁环N基于TaqMan(R)探針的快速、準(zhǔn)確、特異的RV熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，用于RV G4型VP7基因的檢測及定量。使用RT-PCR(Reverse transcription PCR)以輪狀病毒G4型VP7基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物和探針，探針5'端距離上游引物3'端8bp，使用JOE標(biāo)

3、記探針3'端報(bào)告基團(tuán)，5'端標(biāo)記Eclipe淬滅基團(tuán)。從輪狀病毒G4型中擴(kuò)增出VP7基因，將該基因構(gòu)建于質(zhì)粒并克隆培養(yǎng)。從質(zhì)粒中擴(kuò)增并純化的VP7 DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄RNA。將該RNA純化并使用光度法定量，稀釋RNA至102-107拷貝/μl數(shù)量級(jí)作為RT-qPCR(Real time quantitative PCR)標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化PCR體系，通過絕對(duì)定量法測定樣品中G4型病毒RNA拷貝數(shù)。
　　 結(jié)果：所獲得的RNA標(biāo)準(zhǔn)品