應(yīng)用NT-3基因修飾的雪旺細胞與RA體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化并聯(lián)合移植治療全橫斷脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、本研究旨在探討應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細胞(SchwannCells，SCs)與維甲酸(retinoicacid，RA)體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞(neuralstemcell，NSCs)分化并聯(lián)合移植對大鼠全橫斷脊髓損傷的治療作用，從而為急性脊髓損傷的治療探索一種新策略，本研究共分為四個部分。 第一部分神經(jīng)干細胞和雪旺細胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定 目的 改良出一種快速、簡單、經(jīng)濟而又能得到足夠純度、足夠量的NSCs

2、和SCs的細胞培養(yǎng)方法，為研究應(yīng)用NSCs和SCs提供穩(wěn)定、可靠的細胞來源。方法選用SD乳鼠，取海馬組織，用胰酶消化法和機械吹打法培養(yǎng)NSCs；取坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)，用單細胞雙酶消化法和半植塊單酶消化法培養(yǎng)SCs。結(jié)果用同樣多的材料，機械吹打法所獲得的NSCs是胰酶消化法所獲細胞的四倍，省時至少20min，免疫組化結(jié)果顯示獲得的神經(jīng)干細胞呈nestin陽性；用同樣多的材料，半植塊單酶消化法所獲得的SCs比單細胞雙酶消化法所獲細胞至少多兩

3、倍，省時至少40min，免疫組化結(jié)果顯示獲得的雪旺細胞96％以上呈S-100陽性。結(jié)論用改良的機械吹打法培養(yǎng)NSCs；用單酶消化半植塊法培養(yǎng)SCs，能在短時間內(nèi)獲得足夠量、足夠純度、生長狀態(tài)良好的NSCs和SCs。 第二部分雪旺細胞和維甲酸體外協(xié)同性促進神經(jīng)干細胞向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化 目的 研究體外聯(lián)合應(yīng)用SCs和RA對NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化的作用。方法采用2×2析因設(shè)計方法，N

4、SCs分別用RA，SCs和SCs+RA處理6d，所用培養(yǎng)液為含0.5％小牛血清的DMEM/F12。用免疫熒光雙標來檢測NSCs的分化情況，包括nestin，GFAP和Map2；PSD95的表達表明突觸的發(fā)生。結(jié)果與對照組相比，用RA或SCs處理后，nestin和GFAP的表達顯著下降，Map2的表達顯著增加，用SCs處理后，PSD95的表達顯著增加；析因設(shè)計的方差分析結(jié)果表明，SCs和RA在誘導(dǎo)Map2和PSD95的表達方面有顯著性交互

5、作用，且均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論SCs和RA體外能協(xié)同性促進NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化，但在減少nestin陽性NSCs，減少NSCs向膠質(zhì)細胞分化方面只是一種附加作用。 第三部分體外聯(lián)合應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細胞與維甲酸促進神經(jīng)干細胞向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化目的 研究體外聯(lián)合應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的SCs和RA對NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化的作用。方法RT-PCR方法檢測RA誘

6、導(dǎo)前后NSCs中trkCmRNA的表達情況；擴增、純化重組腺病毒，并檢測病毒滴度，用腺病毒載體介導(dǎo)的人NT-3基因(AdvNT-3)轉(zhuǎn)染SCs，用免疫組織化學(xué)法和ELISA法檢測NT-3的表達和分泌。NSCs分別用SCs，SCs+RA，AdvLacZ-SCs，AdvNT-3-SCs，AdvNT-3-SCs+RA和AdvLacZ-SCs+RA處理6d。用nestin、GFAP、Map2和PSD95免疫熒光雙標法來檢測NSCs的分化情況。結(jié)

7、果1.NSCs在RA誘導(dǎo)前后都有TrkC受體mRNA的表達；2.通過擴增、純化獲得了較高滴度的兩種重組腺病毒，至少達到1010pfu/ml；3.重組腺病毒載體能有效的轉(zhuǎn)染46.82％的雪旺細胞；4.在人AdvNT-3轉(zhuǎn)染第4、7、14d時每105細胞24h內(nèi)分別可以產(chǎn)生約35.21±7.40ng、24.05±3.47ng、14.16±1.11ng的人NT-3因子。5.與SCs，AdvLacZ-SCs，SCs+RA組相比，用AdvNT-3

8、-SCs處理后，能顯著性減少GFAP的表達，能顯著性增加Map2和PSD95的表達；與其他組相比，用AdvNT-3-SCs+RA處理后，nestin和GFAP的表達顯著下降，Map2和PSD95的表達顯著增加，且均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論聯(lián)合應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的SCs和RA能進一步促進NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化，同時減少nestin陽性NSCs，減少NSCs向膠質(zhì)細胞的分化。 第四部分應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細

9、胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化并聯(lián)合移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷的實驗研究目的 探討應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化并聯(lián)合移植對大鼠全橫斷脊髓損傷的治療作用。方法取成年雌性SD大鼠37只，隨機分為5組，分別為：1.體外分化組，用人NT-3基因修飾雪旺細胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化6d后再聯(lián)合移植；2.體外分化對照組，用LacZ基因修飾的雪旺細胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化6天后再聯(lián)合移

10、植；3.體內(nèi)分化組，將人NT-3基因修飾雪旺細胞與神經(jīng)干細胞聯(lián)合移植后使神經(jīng)干細胞在體內(nèi)分化；4.實驗對照組，脊髓全橫斷后僅填充吸附培養(yǎng)液的明膠海綿；5.正常對照組，不做手術(shù)。采用脊髓胸10段全橫斷損傷模型，于全橫斷后在脊髓損傷處以明膠海綿為支架立即進行細胞移植，各組神經(jīng)干細胞在移植前分別用Hoechst33342進行標記。術(shù)后53d時，在皮質(zhì)體感區(qū)進行BDA順行標記；術(shù)后60d時，分別進行BBB評分和爬網(wǎng)格測驗，觀察各組大鼠后肢運動功

11、能的恢復(fù)情況；術(shù)后61d時，在脊髓橫斷下方胸12節(jié)段進行FG逆行標記；術(shù)后68d時進行灌注固定、取材及形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果1.中性紅染色后計數(shù)發(fā)現(xiàn)，與實驗對照組相比，各細胞移植組大腦皮質(zhì)體感運動區(qū)內(nèi)錐體細胞層、中腦紅核、及脊髓L1背核存活神經(jīng)元數(shù)目均顯著增多，并有統(tǒng)計學(xué)意義。2.NT-3免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，基因修飾SCs移植到損傷脊髓2個月后仍能表達外源基因。3.三個細胞移植組的脊髓橫斷處損傷區(qū)均檢測到由移植神經(jīng)干細胞分化來的Map2

12、、NF、GFAP、PSD95、synapsin、ChAT染色陽性的細胞，并能檢測到nestin雙標陽性的細胞，其中Map2陽性細胞百分率，體外分化組最高，體內(nèi)分化組最低，體外分化對照組介于兩者之間，三組之間兩兩相比均有統(tǒng)計學(xué)意義。4.與實驗對照組相比，三個細胞移植組的脊髓橫斷處及附近，均可看到多少不等的Map2、NF-200、GAP-43、5-HT陽性神經(jīng)纖維，脊髓橫斷處檢測到少量BDA陽性神經(jīng)纖維，但其尾側(cè)卻沒有，在中腦紅核和脊髓橫斷

13、處頭側(cè)端有少量神經(jīng)元被FG標記。5.在三個細胞移植組的脊髓橫斷處MBP的表達缺如范圍明顯減少，CSPG的表達明顯減少。6.行為學(xué)檢測結(jié)果表明三個細胞移植組對脊髓損傷后大鼠后肢運動功能的恢復(fù)都有比較顯著的促進作用，與體外分化對照組相比，體外分化組大鼠后肢運動功能恢復(fù)更好一些，并有統(tǒng)計學(xué)意義。7.電鏡下，在細胞移植組中脊髓損傷處有少量再生的神經(jīng)纖維軸突由厚薄不均的新生髓鞘包繞。結(jié)論應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞