BH3結(jié)構(gòu)域擬似物誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究.pdf

1、大腸癌是消化道中常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重地威脅人類的健康，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。許多學(xué)者認(rèn)為大腸癌的發(fā)生不僅與癌基因突變、抑癌基因失活有關(guān)，而且與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控失衡有密切關(guān)系。細(xì)胞凋亡是在一定的生理或病理條件下進(jìn)行的程序性細(xì)胞死亡(Programmedcelldeath)，是一種受基因調(diào)控的明顯不同于壞死性細(xì)胞死亡的細(xì)胞自滅過程。就目前所知，凋亡至少通過兩種主要的途徑來介導(dǎo)和調(diào)節(jié)：①死亡受體途徑；②線粒體途徑。 BH3-onl

2、y蛋白是啟動以線粒體途徑為主的細(xì)胞凋亡的必要條件，當(dāng)細(xì)胞受到一些細(xì)胞毒信號刺激時，BH3-only蛋白活化，并通過一定的方式活化Bax或Bak，使Bax和Bak在線粒體膜上形成寡聚物，使膜通透性增加，釋放促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C，驅(qū)使caspase活化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡調(diào)控失?？蓪?dǎo)致細(xì)胞增生失衡，常被認(rèn)為是腫瘤形成的機(jī)制之一。近年來研究表明，凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系。 BH3結(jié)構(gòu)域擬似物BH3I-2'(3-碘-5-

3、氯-N-{2-氯-5-[(4-氯苯基)磺基]苯基}-2-水楊酰胺)可通過干擾促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間的平衡，引起細(xì)胞凋亡。 本實驗通過檢測經(jīng)BH3I-2'作用前后大腸癌細(xì)胞HCT116的增殖、凋亡等生物學(xué)特性及跨膜電位、Pro-caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化，離體水平探討B(tài)H3I-2'誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡及其凋亡機(jī)理。 實驗方法 1、MTT法 2、流式細(xì)胞儀FITC/PI雙染法、3、流式細(xì)胞儀

4、JC-1單染法、4、WesternBlot法本實驗采用以上方法檢測BH3I-2'處理HCT-116細(xì)胞前后的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、線粒體跨膜電位及Pro-caspase-3蛋白表達(dá)的變化。 實驗結(jié)果 1、BH31-2'對HCT116細(xì)胞增殖情況的影響：濃度為30、40、50、60、70、80、90μmol/LBH3I-2'處理HCT116細(xì)胞24h后，其生長抑制率分別為：10.08±1.12、23.13±1.46、34.3

5、7±1.61、43.36±1.92、67.79±1.66、76.53±1.89、86.69±1.52(mean±SD，n=3，P<0.05)。其IC50為60μmol/L。 2、BH3I-2'可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡：60μmol/LBH3I-2'處理HCT116細(xì)胞2、4、8、24h后檢測細(xì)胞凋亡情況，其早期凋亡率分別為：12.91±1.88、8.49±0.77、5.32±1.27、3.59±1.30，晚期凋亡率分別為：24

6、.22±2.20、7.44±2，36、40.67±1.78、45.52±1.23(mean±SD，n=3，P<0.05)。但隨著時間的增加早期凋亡細(xì)胞減少，晚期凋亡細(xì)胞增加。 3、BH3I-2'可引起HCT116細(xì)胞線粒體內(nèi)膜損傷：60μmol/LBH3I-2'分別處理細(xì)胞0、1、2、4、6、24h后跨膜電位變化情況，第一象限細(xì)胞凋亡率分別為91.32±2.18、89.76±1.12、89.67±1.46、89.45±1.90、

7、84.60±1.49*、83.71±1.39*，第四象限細(xì)胞凋亡率分別為5.24±0.91、6.63±1.24、6.81±1.17、9.38±1.18*、10.14±1.23*、13.72±1.64*(mean±SD，n=3，*P<0.05)。BH3I-2'處理細(xì)胞6h后△Ψm快速下降，且作用時間越長，△Ψm下降的程度越顯著。 4、BH3I-2'對HCT116細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用依賴于caspase-3的活化：60μmol/LBH

8、3I-2'分別處理細(xì)胞0、2、4、6、8、12h時pro-caspase-3蛋白的表達(dá)情況，其灰度值比分別為1.05±0.09、0.91±0.09、0.84±0.08、0.63±0.10*、0.56±0.10*、0.53±0.12*(mean±SD，n=3，*P<0.05)。BH3I-2'處理細(xì)胞6h后pro-caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，且隨著作用時間延長而增強(qiáng)。 結(jié)論： 1、BH3I-2'可抑制人大腸癌HCT116