豬圓環(huán)病毒2型激活鈣離子信號通路誘導PK-15細胞自噬.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是導致豬圓環(huán)病毒相關疾病(Porcine circovirus-associated disease，PCVAD)的主要致病因子，主要感染豬體免疫器官，造成淋巴組織損傷、淋巴細胞減少及組織細胞浸潤等病理學特征，最終可導致嚴重的免疫抑制。此外，PCV2感染后極易導致豬群繼發(fā)感染和混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重損失。PCV2基因組全長1.7 kb，為共價閉合、環(huán)狀單鏈D

2、NA。迄今已報道PCV2有5個ORF編碼蛋白:ORF1編碼復制相關蛋白Pep，負責病毒DNA的復制;ORF2編碼核衣殼蛋白Cap，與病毒粒子包裝及細胞自噬有關，也是PCV2主要的免疫原性蛋白;ORF3編碼蛋白能夠誘導細胞凋亡;ORF4編碼蛋白能夠抑制細胞凋亡，調控宿主T淋巴細胞;ORF5編碼蛋白能夠誘導內質網(wǎng)應激。細胞自噬在病毒的感染、復制以及致病方面均發(fā)揮重要作用，本實驗室前期工作證實PCV2感染PK-15細胞可通過AMPK/ERK/

3、TSC2/mTOR途徑誘導細胞自噬以促進自身復制，但激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的分子機制尚待進一步揭示。
　　本研究旨在闡明:(1) PCV2感染PK-15細胞激活AMPK的分子機制;(2)PCV2感染PK-15細胞除激活AMPK/ERK/TSC2/mTOR通路以外，是否有其它的自噬通路參與;(3) PCV2Cap蛋白誘導自噬的關鍵區(qū)域。
　　1.PCV2感染PK-15細胞經(jīng)由CaMKKβ激活AMPK
　　利用

4、RNA干擾、免疫印跡、激光共聚焦及實時熒光定量PCR(q-RT-PCR)等方法對PCV2感染PK-15細胞激活AMPK的分子機制進行探究。免疫印跡結果表明，PCV2感染PK-15細胞后24 h開始顯著上調鈣/鈣調素依賴的蛋白激酶的激酶β(CaMKKβ)（1.00 vs2.20，P＜0.05），激活其底物分子AMPK(1.00 vs2.59，P＜0.01)和鈣調蛋白激酶Ⅰ(CaMKI)（1.00 vs2.37，P＜0.05）;CaMKKβ

5、抑制劑STO-609或特異性小干擾RNA(siCaMKKβ)均能顯著抑制PCV2誘導的AMPK和CaMKI的活化。激光共聚焦結果顯示，STO-609或siCaMKKβ均能顯著抑制PCV2誘導的細胞內自噬小體的形成（14.6 vs28.5，P＜0.01;19.2 vs29.0，P＜0.01）;q-RT-PCR及病毒滴度測定顯示，抑制CaMKKβ（STO-609或siCaMKKβ）均能顯著降低子代PCV2 DNA拷貝數(shù)(106.02 vs1

6、08.23;106.91 vs108.36，P＜0.01)及病毒滴度(TCID50)（10-2.23 vs10-4.56，P＜0.01;10-2.85 vs10-4.35, P＜0.01）。這些結果表明，PCV2感染PK-15細胞經(jīng)由CaMKKβ激活AMPK及其下游通路誘導細胞自噬。
　　2.PCV2感染PK-15細胞激活CaMKKβ/CaMKUWIPI1自噬通路
　　利用RNA干擾、免疫印跡、激光共聚焦及q-RT-PCR等

7、技術對PCV2感染PK-15細胞是否激活CaMKKβ/CaMKI/WIPI1自噬通路進行探究。結果顯示，PCV2感染后12 h便能顯著上調與磷酸肌醇互作的色氨酸一天冬氨酸重復蛋白1(WIPI1)的mRNA（1.00vs2.60，P＜0.01）及其蛋白水平（1.00 vs1.92，P＜0.05），而特異性小干擾RNA siWIPI1或siCaMKI以及CaMKI抑制劑KN93均能顯著抑制PCV2的復制及其誘導的細胞自噬。此外，siAMPK

8、能夠抑制PCV2誘導的細胞自噬，但不影響CaMKI活化和WIPI1上調。激光共聚焦結果顯示，PCV2感染能夠促進DsRed-WlPI1點狀聚集（47.0 vs24.5，P＜0.01）及DsRed-WIPl1/EGFP-LC3共定位(16.7 vs8.7，P＜0.01)，這種促進作用能被STO-609或KN93緩解。以上結果表明，PCV2感染能夠激活CaMKKβ/CaMKI/WIPI1通路誘導自噬，且不依賴于AMPK。
　　3.PC

9、V2感染PK-15細胞經(jīng)由IP3R-Ca2+途徑激活CaMKKβ
　　利用免疫印跡、ELISA和流式細胞術等技術進一步探究PCV2感染激活CaMKKβ以及Cap蛋白誘導自噬的分子機制?；诹魇郊毎g和熒光共振能量轉移(FRET)方法的細胞漿Ca2+檢測顯示，PCV2感染后36 h能顯著上調胞漿游離Ca2+水平(128.7％ vs100％，P＜0.01)，并顯著提高TN-XXL蛋白的FRET發(fā)生效率(14.1％ vs2.0％，P＜0

10、.01)。這種上調作用能被三磷酸肌醇受體(IP3R)抑制劑2-APB緩解。免疫印跡顯示，2-APB能夠抑制PCV2感染對CaMKKβ/AMPK和CaMKKβ/CaMKI自噬通路的激活以及PCV2復制，而PCV2感染并未激活磷酯酶C-γ（PLC-γ）。ELISA顯示PCV2感染未上調細胞內三磷酸肌醇(IP3)水平，說明PCV2激活IP3R不是經(jīng)由PLC-IP3途徑。Cap及其截短表達載體(pCap、pCap1-100aa、 pNLS+Ca

11、p90-190aa及pNLS+Cap185-233aa)轉染PK-15細胞均能不同程度的上調細胞漿內Ca2+水平，并誘導自噬，且與Cap蛋白的核定位信號（Cap1-41 aa，NLS）無關，Cap蛋白的aa42-185可能起主要作用。此外，Cap及其截短表達不能誘導HEK293細胞發(fā)生自噬。以上結果表明，PCV2感染PK-15細胞經(jīng)由Cap蛋白通過IP3R-Ca2+途徑激活CaMKKβ。
　　綜上所述，本研究進一步闡明了PCV2感