PDGFr-β抑制劑Ag-1295通過(guò)Erk通路促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化.pdf

1、血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factors receptors PDGFRs)是存在于細(xì)胞膜表面的酪氨酸激酶，特異性應(yīng)答血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowth factors PDGFs)的一類受體。PDGFRs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在胞外配位子結(jié)合區(qū)域有5個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜序列，胞內(nèi)有一個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。二聚化的PDGFs結(jié)合到受體上并促使PDGFRs形成二聚體，

2、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的酪氨酸殘疾發(fā)生自身磷酸化，通路被激活。PDGFRs包括兩種形式，即PDGFR-α與PDGFR·β。PDGFRs可以激活下游三條主要通路:分裂素活化蛋白激酶(themitogen-activated protE1n kinase MAPK)/胞外信號(hào)調(diào)控激酶(extracellularsignal-regulated kinase Erk)通路,3磷脂酰肌醇激酶(the phosphatidylinositol3-kinas

3、e)/Akt通路，及磷脂酶C-Y(the phospholipase C-Y PLC-γ)通路。其中MAPK/Erk通路在成骨分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。
　　 PDGFs/PDGFRs信號(hào)通路在成骨類細(xì)胞的很多功能中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用，然而該通路對(duì)成骨細(xì)胞分化作用的影響一直存在爭(zhēng)議。很多研究資料支持PDGF-BB對(duì)骨的形成及重塑有積極作用，F(xiàn)ierro與他的同事也發(fā)現(xiàn)當(dāng)PDGFRs活性受到抑制時(shí)，人類骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成骨作用也

4、受到明顯抑制:然而還有一些研究卻表明PDGFs抑制成骨細(xì)胞分化，如體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥理學(xué)抑制PDGFRs活性時(shí)可以提高細(xì)胞內(nèi)礦化基因的表達(dá)并促進(jìn)基質(zhì)礦化的發(fā)生。臨床資料也報(bào)道慢性髓細(xì)胞性白血病患者(chronicmyeloid leukemia CML)在長(zhǎng)期服用PDGFRs抑制劑藥物時(shí)，體內(nèi)骨量增加。Tokunaga等人在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中敲除PDGFR-β基因后發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞堿性磷酸酶活性明顯增高，礦化標(biāo)記基因表達(dá)量也上升，提示該細(xì)胞的成

5、骨分化能力大大增強(qiáng)；然而最近一項(xiàng)使用AG-1296抑制PDGFR活性的研究結(jié)果卻顯示PDGFR信號(hào)通路對(duì)人類間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程幾乎不產(chǎn)生影響。綜上所述，目前PDGFR信號(hào)通路與成骨分化過(guò)程的關(guān)系還不明確，該通路調(diào)控成骨分化的機(jī)制更是知之甚少。
　　 在本研究中，我們首先采用酪氨酸磷酸化抑制劑AG-1295在MC3T3-E1細(xì)胞中特異性抑制PDGFR-β，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞堿性磷酸酶活性、茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)及RT-PCR測(cè)定

6、礦化標(biāo)記基因表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示PDGFR-p通路對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響，其次又采用Western-blot的方法檢測(cè)PDGFR-p通路是否通過(guò)Erkl/2通路來(lái)調(diào)控成骨分化過(guò)程。
　　 第一章PDGFRs抑制劑AG-1295對(duì)MC3T3-E1礦化表型的影響
　　 目的:檢測(cè)PDGFR-p特異性抑制劑AG-1295對(duì)MC3T3-E1成骨分化的影響
　　 方法:用PDGFR-p特異性抑制劑AG-1295

7、作用于成骨誘導(dǎo)中的MC3T3-E1細(xì)胞，在指定的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況，RT-PCR檢測(cè)礦化標(biāo)記基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:酪氨酸磷酸化抑制劑AG-1295使得MC3T3-E1細(xì)胞在成骨分化前期堿性磷酸酶活性水平升高，后期促進(jìn)基質(zhì)礦化，并且大多數(shù)礦化標(biāo)記基因的表達(dá)水平均上升。
　　 結(jié)論:PDGFRs抑制劑AG-1295增強(qiáng)MC3T3-E1礦化表型，即PDGFR-β通路與MC

8、3T3-E1細(xì)胞成骨分化負(fù)相關(guān)。
　　 第二章PDGFR-p-Erkl/2負(fù)調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化
　　 目的:檢測(cè)PDGFR-p通路是否通過(guò)Erkl/2通路調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化
　　 方法:收集誘導(dǎo)分化2天、10天的MC3T3-E1細(xì)胞，提取總蛋白，Western-blot檢測(cè)AG-1295對(duì)Erkl/2表達(dá)量及其磷酸化水平的影響。
　　 結(jié)果:AG-1295對(duì)Erkl/2表達(dá)量沒