Ⅰ抗人大腸癌單鏈抗體基因的構(gòu)建與表達(dá);Ⅱ抗人大腸癌單鏈抗體——胞嘧啶脫氨酶融合基因的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文Ⅰ抗人大腸癌單鏈抗體基因的構(gòu)建與表達(dá)Ⅱ抗人大腸癌單鏈抗體——胞嘧啶脫氨酶融合基因的構(gòu)建及表達(dá)姓名：方瑾申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：宋今丹2001.8.1備的鼠抗人大腸癌單克隆抗體，已進(jìn)行的近千例臨床病理檢測(cè)顯示，該單抗對(duì)高中分化大腸癌組織具特異結(jié)合活性，并優(yōu)于目前廣泛采用的美國(guó)商業(yè)產(chǎn)品抗CEA單抗。該單抗與天花粉蛋白偶聯(lián)制備的免疫毒素和與載有紫杉醇的脂質(zhì)體偶聯(lián)制備的免疫脂質(zhì)體在體外均顯示了良好的靶

2、向殺傷作用。應(yīng)用”1l標(biāo)記的ND一1單抗在裸鼠體內(nèi)的放射免疫顯像亦顯示了良好效果。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)將抗人大腸癌單克隆抗體ND一1的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因進(jìn)行重組構(gòu)建了單鏈抗體ND一1scFv，并成功地在大腸桿菌中進(jìn)行了有效表達(dá)。在證實(shí)ND一1scFv具有滿意的免疫學(xué)活性，在動(dòng)物體內(nèi)呈特異性分布后，將ND一1單抗的單鏈抗體基因與酵母胞嘧啶脫氨酶(cytosinedeaminase，CD)基因融合，在大腸桿菌中成功地表達(dá)了單鏈抗體與酶的融合

3、蛋白，并測(cè)定了其與5一氟胞嘧啶構(gòu)成的壘望墾墮丕統(tǒng)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用，希望為大腸癌的臨床診斷和治療提供新的途徑和手段。／1采用RT—PCR技術(shù)從能夠分泌ND一1單抗的鼠雜交瘤細(xì)胞Ic一2節(jié)擴(kuò)增V。和V?；颍ㄟ^(guò)重疊延伸拼接PCR在V。和V。基因序列問(wèn)引入連接短肽，體外構(gòu)建seFv基因，經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化和篩選將其克隆至PET一28a()表達(dá)載體并由InB誘導(dǎo)在EcoliBL21中表達(dá)ND一18cFv蛋白。序列分析表明：ND一1scFv基因全長(zhǎng)7

4、32bp，VH基因在上游，片段長(zhǎng)度354bp；V。基因在下游，片段長(zhǎng)度330bp，中間為柔性UIll【er序列，長(zhǎng)度45bp，兩側(cè)為通過(guò)PCR引入的EcoRI和HindⅢ酶切位點(diǎn)，與Genebank中相關(guān)序列比較證實(shí)，該scFv片段具有鼠源性抗體特征，由鼠源性抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成，輕鏈為K鏈。SDS—PAGE檢測(cè)顯示，重組蛋白的相對(duì)分子量為30KD，包括8cFv和蛋白標(biāo)簽6His—tag以及載體上游序列，與理論推算值相符。凝膠

5、灰度掃描結(jié)果顯示seFv蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加，至4小時(shí)達(dá)到誘導(dǎo)高峰，表達(dá)量占菌體總蛋白量的16％，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)利用鎳一次氨基三乙酸(Ni—NTAresin)金屬親和層析基質(zhì)對(duì)6XHis—tag的特異親和性完成了對(duì)scFv的純化，獲得了純度為94％的高純度表達(dá)蛋白，蛋白濃度高達(dá)15mg／IllI，為該單鏈抗體在臨床的廣泛應(yīng)用提供了可能。2對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)純化復(fù)性的ND一1scFv進(jìn)行了間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示，表達(dá)有ND一1相應(yīng)細(xì)