單鏈重組人胰島素類似物HI-270的構(gòu)建、表達(dá)及復(fù)性.pdf

1、多年以來，糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)及其并發(fā)癥(酮酸尿毒癥、大血管病變和微血管病變引起的腦卒中、失明等)一起嚴(yán)重地危害著人類的健康和生活水平，成為與心臟血管類疾病和癌癥并列引起人類死亡的三大主要病因之一。目前的中國糖尿病患者總數(shù)已經(jīng)超過了9200 萬，糖尿病前期患者為1.48 億，越居全球第一。胰島素，作為一種目前臨床最有效、最基礎(chǔ)和最安全的糖尿病治療藥物，隨著日益加劇的糖尿病患病率，其市場(chǎng)需求也在增加，而且在生

2、物制藥及其研究領(lǐng)域里呈現(xiàn)了廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。
　　 從1922年首次臨床成功應(yīng)用胰島素治療糖尿病患者至今，從1921年早期動(dòng)物胰臟提取的動(dòng)物胰島素到基因工程重組人胰島素，胰島素的應(yīng)用與發(fā)展史歷經(jīng)了約90年。成熟的胰島素由21個(gè)氨基酸的A 鏈和30個(gè)氨基酸的B 鏈組成，分子約5.7 kD。
　　 胰島素A 鏈和B 鏈通過2個(gè)鏈間二硫鍵(A7-B7、A20-B19)和1個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(A6-A11)連接。隨著分子生物學(xué)、

3、蛋白質(zhì)及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)越來越多的胰島素相關(guān)研究集中在了建立高效、簡(jiǎn)易、低廉且高純度的重組人胰島素的工業(yè)制備體系方面。本研究期望通過重組表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)、表達(dá)系統(tǒng)與最佳發(fā)酵條件的選擇和優(yōu)化等提高設(shè)計(jì)所得重組人胰島素的表達(dá)產(chǎn)量，同時(shí)建立實(shí)際可行的復(fù)性工藝，為后續(xù)下游的純化、酶切、分離等工藝創(chuàng)造條件。
　　 實(shí)驗(yàn)中，我們選用pET-39b 質(zhì)粒載體、BL21 大腸桿菌工程菌表達(dá)系統(tǒng)，B 鏈C端設(shè)計(jì)合適長度的信號(hào)肽和6個(gè)組氨酸(H

4、is)構(gòu)成的短肽，分別用于提高工程菌的表達(dá)量和利用金屬離子鎳柱簡(jiǎn)化蛋白純化[1]；A 鏈和B 鏈的C 端分別通過兩個(gè)精氨酸(Arg，R)連接合適長度的模擬短C 肽，既不影響重組蛋白的重折疊復(fù)性又簡(jiǎn)化了后續(xù)的酶切、分離步驟，得到雙鏈重組人胰島素。結(jié)果表明我們?cè)诿可囵B(yǎng)基中收獲了大腸桿菌E.coli 菌體840 mg (濕重)，包涵體367.89 mg (濕重)，表達(dá)水平達(dá)到43.8％，重組人胰島素目標(biāo)蛋白約占總蛋白量的25％。然后經(jīng)過還原