雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E和CDPK核酸疫苗的研究.pdf

1、雞球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)的一類嚴重的寄生蟲病，雞球蟲病的免疫預防研究越來越受到人們的重視。雞球蟲核酸疫苗以其可誘導產(chǎn)生較強的細胞免疫反應等優(yōu)點成為當前研究的熱點，并取得了一定進展。為了研究核酸疫苗對雞球蟲感染的防治效果，進行了以下試驗： 1.球蟲子孢子表面抗原基因(3-1E、CDPK)和雞IFN-γ(ChIFN-γ)的亞克隆與表達：將柔嫩艾美耳球蟲(Et)GS株3-1E、CDPK和ChIFN-γ基因亞克隆到pGEX-6P-1表達載體

2、，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-I、pGEX-E和pGEX-C；分別在其宿主菌BL21進行誘導表達，得到可溶形式的GST融合蛋白；并將表達產(chǎn)物通過GST純化柱進行了純化。SDS-PAGE分析表明，表達產(chǎn)物均占菌體蛋白的30％以上；通過GST純化柱，獲得了90％以上純度的GST-IFN-γ、GST-3-1E和GST-CDPK融合蛋白。 2.艾美耳球蟲3-1E基因、CDPK基因和雞IFN-γ基因的共表達：利用SOE-PCR技術(shù)將EtGS

3、3-1E基因、EtGSCDPK基因和ChIFN-γ基因兩兩相連、三個相連成功構(gòu)建了4個原核共表達質(zhì)粒pGEX-IE、pMAL-IC、pMAL-EC、pMAL-IEC。將重組質(zhì)粒pGEX-IE在BL21中表達得到GST-IE融合蛋白；將重組質(zhì)粒pMAL-IC、pMAL-EC、pMAL-IEC在TB1中表達得到MBP-IC、MBP-EC和MBP-IEC融合蛋白。SDS-PAGE分析表明，表達的重組蛋白全部為包涵體形式存在，且表達量均占菌體總

4、表達量的20％以上；包涵體處理后可得到80％以上純度蛋白。 3.真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達檢測：分別將原核重組質(zhì)粒pGEX-I、pGEX-E、pGEX-C、pGEX-IE、pMAL-IC、pMAL-EC和pMAL-IEC上的單價、雙價、三價基因片段亞克隆到真核表達載體proVAX中，成功構(gòu)建了單價、雙價和三價的真核重組質(zhì)粒：proI、proE、proC、proIE、proIC、proEC和proIEC等7種。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑

5、盒將各真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PK-15細胞，IFAT試驗結(jié)果表明，各真核重組質(zhì)?？稍谡婧思毎姓T導表達蛋白。 4.核酸疫苗對球蟲感染雞的保護研究：雞7日齡用核酸疫苗免疫，14日齡用相應核酸疫苗加強免疫或DNAprime-proteinboost免疫組用相應重組蛋白加強免疫，二免后7天攻擊5×104個E.tenellaGS卵囊，7天后殺雞觀察免疫組的保護效果。采用淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗(MTT法)和ELISA對各試驗組進行了免疫原性研究。淋

6、轉(zhuǎn)結(jié)果表明，感染后7天，各免疫組T細胞增殖反應顯著，說明核酸疫苗具有較強的誘導雞的細胞免疫反應的能力；ELISA結(jié)果表明，蛋白加強免疫組與核酸免疫組相比，誘導產(chǎn)生顯著的血清抗體水平。攻蟲感染保護效果看，與IFN-γ共表達的雙價proIE和proIC的保護效果要優(yōu)于單價proI、proE和proC，其中proIE組卵囊下降達到57.73％，說明雞IFN-γ具有免疫佐劑功能，但三價proIEC的效果并不一定優(yōu)于雙價的效果。在蛋白加強免疫組中