重組腺病毒VEGF編碼基因載體的構建及轉染大鼠骨髓間質干細胞效率的實驗研究.pdf

1、背景:
　　 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factot,VEGF),也稱血管調理素(Vascutotropin)和血管通透因子(vascular permealility factor,VPF),是Ferrara等在1989年從牛垂體濾泡星狀細胞的條件培養(yǎng)基中純化出來的一種具有肝素結合活性的生長因子,是在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合過程中啟動血管形成的一個高度特異性的有絲分裂原,能特異性地作用

2、于血管內皮細胞,促進血管內皮細胞增殖[1],加速新生血管形成并增加血管通透性[2]。促進內皮細胞間質的膠原酶表達,促進血漿纖維蛋白原的外滲,導致纖維蛋白原的沉積。VEGF已應用于治療缺血性疾病,如修改人體神經(jīng)干細胞基因充分表達VEGF治療大腦內出血中風[3],并且移植脂肪源性干細胞促進VEGF合成促進腦缺血疾病的血管再通[4]。VEGF在臨床的應用有著更廣闊的前景。
　　 目的:
　　 1.構建攜帶VEGF基因AdEas

3、y復制缺陷型重組腺病毒載體系統(tǒng)。
　　 2.大鼠骨髓間質干細胞的培養(yǎng)。
　　 3.觀察rAd-VEGF轉染大鼠骨髓基質細胞(BMSCs)后VEGF的表達情況。
　　 方法:
　　 1.從PCR2.1-VEGF質粒中克隆出VEGFA基因的編碼序列。
　　 2.VEGFA基因插入腺病毒系統(tǒng)的穿梭載體pAdTrack—CMV中。
　　 3.在含有腺病毒骨架載體pAdeasy-1的大腸桿菌BJ51

4、83中進行同源重組獲得重組子pAdeasy-1-VEGF。
　　 4.鑒定pAdeasy-1-VEGF,將pAdeasy-1-VEGF轉染人胚腎細胞(Ad293A細胞),獲得含VEGF基因的重組腺病毒(rAd—VEGF),熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白(GFP)的表達。
　　 5.反復感染HEK293A細胞擴增腺病毒,50％組織培養(yǎng)感染量法(TCID50)檢測病毒滴度。
　　 6.體外培養(yǎng)大鼠骨髓間質干細胞。

5、　　 7.rAd—VEGF轉染骨髓基質細胞,轉染后在熒光顯微鏡下觀察并采用ELISA法檢測VEGF的表達水平。
　　 結果:
　　 1.經(jīng)酶切鑒定,基因測序及綠色熒光觀察證實成功構建出含有VEGF基因的腺病毒載體rAd—VEGF。
　　 2.擴增得到1010PFU／ml高滴度重組腺病毒。
　　 3.rAd—VEGFA轉染骨髓基質細胞后,ELISA檢測發(fā)現(xiàn)轉染組上清液中VEGF蛋白分泌量明顯高于對照組(P