CML基因疫苗的構(gòu)建及表達(dá)bcr-abl融合基因片段的SP2-0細(xì)胞系的建立.pdf

1、該研究從以下三個(gè)方面探索利用bcr-abl融合基因片段制備CML基因疫苗的研究.一、慢性髓性白血病bcr-abl融合基因片段的克隆與原核表達(dá)的研究 以慢性髓性白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞總RNA為模板,采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增包含bcr-abl融合位點(diǎn)周圍的基因片段,定向克隆到pGEX-6P-1載體谷光甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)的下游.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株,以1.0mmol/l IPTG誘導(dǎo)bcr-abl融合基因片段的表達(dá),其產(chǎn)

2、物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,結(jié)果證實(shí)該融合蛋白分子量約42KD.用該表達(dá)產(chǎn)物免疫ICR小鼠,所制備的抗血清可與K562細(xì)胞中特異性抗原結(jié)合,表明該bcr-abl/GST融合蛋白具有bcr-abl基因產(chǎn)物的特異抗原性.二、慢性髓性白血病bcr-abl融合基因片段真核細(xì)胞表達(dá)的研究 根據(jù)bcr-abl(b3a2)融合基因序列設(shè)計(jì)-對(duì)引物,以CML K562細(xì)胞總RNA為模板,通過RT-PCR擴(kuò)增包含bcr-abl融合位點(diǎn)周圍的450bp的基

3、因片段,并將其克隆進(jìn)pGEM-T easy載體.經(jīng)序列測(cè)定證實(shí)其閱讀框架正確后,將bcr-abl融合基因片段正向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1.以脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pcDNAbcr-abl轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,pcDNAbcr-abl轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的免疫熒光強(qiáng)度高于K562陽性對(duì)照細(xì)胞.用該重組質(zhì)粒DNA免疫BALB/c小鼠可產(chǎn)生特異性抗體.三、穩(wěn)定表達(dá)bcr-abl融合基因片段的人-鼠嵌合腫瘤細(xì)胞系的建立從重組克

4、隆載體pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并將其亞克隆進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN中.脂質(zhì)體介導(dǎo)重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSNbcr-abl轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67,G418篩選后獲得穩(wěn)定產(chǎn)病毒的包裝細(xì)胞.收集病毒上清感染SP2/0細(xì)胞(H-2<'d>),經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)bcr-abl融合基因片段的SP2/0細(xì)胞株.PCR證實(shí)bcr-abl融合基因片段已穩(wěn)定整合于SP2/0細(xì)胞基因組中,RT-PCR證實(shí)感染后的S