靶向沉默ITGB4對TLR4通路的影響.pdf

1、哮喘（asthma）是以AHR、上皮結(jié)構(gòu)性損傷、氣道慢性炎癥等為臨床表型和病理特征的呼吸系統(tǒng)常見疾病，表現(xiàn)為呼吸道對一般性理化刺激或藥物、內(nèi)源性免疫或炎癥介質(zhì)等過度反應(yīng)，對病原微生物及毒性氣體的抵抗力降低，易發(fā)生氣道阻力增高和反復(fù)，哮喘的發(fā)病機制目前仍不清楚，公認(rèn)的有免疫反應(yīng)失平衡和過敏原學(xué)說、神經(jīng)源性氣道炎癥理論及氣道上皮缺陷等。早期的研究顯示，哮喘病人氣道上皮的病理改變與哮喘的局部免疫炎癥反應(yīng)，氣道重構(gòu)及糖皮質(zhì)激素的治療效果等密切相

2、關(guān)。歐洲呼吸病雜志(Journal of European Respiration)多次明確將哮喘歸類于一類氣道上皮性疾病?！度蛑夤芟乐纬h》(Global Initiative for Asthma，GINA)明確指出，支氣管上皮功能不良在哮喘發(fā)病機理中的作用和Ig E介導(dǎo)的機制同等重要，應(yīng)予關(guān)住。
　　本室前期研究應(yīng)用基因芯片篩選了人外周血白細胞差異表達的粘附分子，發(fā)現(xiàn)integrinβ4在哮喘病人中表達下調(diào)。

3、　　Toll樣受體1是單個的跨膜非催化蛋白，是天然免疫與獲得性免疫的橋梁，參與急性炎癥與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，TLRs可以識別多種微生物源的分子，即病原體相關(guān)分子模式，通過誘導(dǎo)編碼細胞因子基因，如TNF-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄而激活炎癥。其中，TLR4具有普遍適用性。
　　本課題組前期實驗證明了integrinβ4在哮喘病人的氣道粘膜表達降低，同時發(fā)現(xiàn)沉默integrinβ4影響了HBECs的抗原提呈過程，使得上皮細胞激活Th1通路受到抑制。我們

4、猜想integrinβ4沉默可能影響Toll樣受體在氣道上皮的表達，從而進一步與氣道局部的免疫失平衡密切相關(guān)。因此，本課題將主要研究integrinβ4沉默對HBECs中TLR4表達及TLR4下游兩條重要信號通路的影響。
　　目的:
　　觀察integrinβ4沉默對HBECs中TLR4表達的影響，及TLR4下游兩條重要信號通路的影響。同時，研究integrinβ4對誘導(dǎo)淋巴細胞分化的作用，以及由此引起免疫失平衡，從而對引起

5、哮喘發(fā)病的免疫學(xué)理論進行初步的探討。
　　方法:
　　(1)設(shè)計并合成integrinβ4 siRNA，并將其瞬時轉(zhuǎn)染入HBECs中。通過熒光顯微鏡觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR和流式細胞術(shù)分別從RNA和蛋白水平檢測integrinβ4的表達。
　　(2)MTT法確定LPS的最佳給藥濃度。
　　(3)流式細胞術(shù)檢測，在LPS作用下，正常HBECs組，Control siRNA組，integrinβ4 si

6、RNA組TLR4的改變。
　　(4) Western blot法檢測，在LPS作用下，正常HBECs組，Control siRNA組，integrinβ4 siRNA組MyD88，TRIF的改變，反映integrinβ4分別對TLR4下游分子的影響。
　　(5)ELISA法檢測，在LPS分別作用24h，48h，72h后，正常HBECs組，Control siRNA組，integrinβ4 siRNA組中TNF-α，IFN-β

7、的改變，進一步檢測integrinβ4分別對TLR4兩條信號通路的影響。
　　(6)正常HBECs組，Control siRNA組，integrinβ4 siRNA組，分別受LPS刺激6h，與淋巴細胞共培養(yǎng)72h，收集細胞上清液，ELISA法檢測IFN-γ，IL-4，IL-17分泌量，觀察integrinβ4對誘導(dǎo)淋巴細胞分化的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)成功合成integrinβ4 siRNA，并轉(zhuǎn)染HBECs。熒

8、光顯微鏡下觀察，siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90％。與Control siRNA組相比，轉(zhuǎn)染integrinβ4siRNA的HBECs中，integrinβ4在mRNA水平及蛋白水平表達均顯著下降
　　(2) LPS作用HBECs的最佳給藥濃度為1μg/mL。
　　(3) LPS刺激使得HBECs中TLR4的表達顯著升高。與Control siRNA組相比，integrinβ4 siRNA組在LPS作用下，TLR4的表達升高更明顯

9、。
　　(4) LPS刺激使HBECs中MyD88，TRIF的表達顯著升高。與ControlsiRNA組相比，integrinβ4 siRNA組在LPS作用下，MyD88，TRIF的增加趨勢更明顯。
　　(5) LPS刺激使HBECs中TNF-α和IFN-β的表達顯著升高。與ControlsiRNA組相比，integrinβ4 siRNA組在LPS作用下，TNF-α和IFN-β的增加更明顯。與淋巴細胞共培養(yǎng)24 h，48 h

10、，72 h TNF-α的分泌量變化不明顯，然而IFN-β的分泌量在24 h，48 h升高不明顯，72 h時明顯增高。
　　(6)較正常HBECs組和Control siRNA組相比，integrinβ4 siRNA組可以明顯升高與之共培養(yǎng)的CD4+T細胞對IL-4，IL-17的分泌，對IFN-γ的分泌量無明顯變化。在LPS作用下，LPS組較LPS陰性組相比，IFN-γ的分泌量明顯升高，IL-4和IL-17的分泌量無明顯差異。

11、>　　結(jié)論:
　　(1)通過RNA干擾技術(shù)能有效沉默integrinβ4，成功構(gòu)建integrinβ4細胞模型。
　　(2)靶向沉默integrinβ4可以明顯促進TLR4的表達，激活TLR4下游兩條信號通路，同時對MyD88依賴信號通路激活發(fā)24 h，對MyD88非依賴信號通路激活發(fā)生在72 h。
　　(3)靶向沉默integrinβ4促進CD4+T淋巴細胞向Th2方向分化，平衡向Th2方向漂移，同時，誘導(dǎo)Th17型