胭脂魚(yú)CD79a和CD79b基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、胭脂魚(yú)（ Myxocyprinus asiaticus）屬鯉形目（ Cypriniformes）胭脂魚(yú)科（Catostomidae），僅分布于我國(guó)長(zhǎng)江和閩江，為我國(guó)也是亞洲特有的物種。同時(shí)，其肉質(zhì)鮮美，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，由于環(huán)境的破環(huán)、過(guò)度捕撈，加之性成熟較晚，胭脂魚(yú)的數(shù)量逐漸減少，現(xiàn)已被列為我國(guó)國(guó)家二級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物。人工養(yǎng)殖是恢復(fù)胭脂魚(yú)資源的重要途徑，但在養(yǎng)殖過(guò)程中死亡率卻居高不下。目前，對(duì)該問(wèn)題的研究還停留

2、在人工水質(zhì)、投喂飼料、病原體感染等對(duì)其高死亡率的影響。本研究試圖從其免疫系統(tǒng)基礎(chǔ)研究入手，希望為解決胭脂魚(yú)人工繁殖中所存在的問(wèn)題及疾病預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　適應(yīng)性免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御病原體入侵的重要機(jī)制，研究表明：魚(yú)類(lèi)是最早具有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的低等脊椎動(dòng)物，在免疫系統(tǒng)進(jìn)化研究中占有特殊地位。因此，對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)的研究能為脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的進(jìn)化規(guī)律提供一定的理論基礎(chǔ)。在免疫系統(tǒng)中，B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫通過(guò)漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體來(lái)消滅抗原

3、，位于B細(xì)胞表面的抗原受體輔助分子CD79a和CD79b在抗原刺激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，CD79a蛋白存在于B細(xì)胞的整個(gè)生命歷程且不存在于其它健康細(xì)胞，故被視為B細(xì)胞的標(biāo)志分子。然而，目前關(guān)于B細(xì)胞抗原受體輔助分子在硬骨魚(yú)類(lèi)中的研究甚少，僅在斑點(diǎn)叉尾鮰和石斑魚(yú)中有相關(guān)報(bào)道。
　　本文通過(guò)同源比對(duì)和cDNA末端快速擴(kuò)增的方法，獲得胭脂魚(yú)B細(xì)胞抗原受體輔助分子CD79a和CD79b序列。其中CD79a的cDNA全長(zhǎng)105

4、9 bp，5’非編碼區(qū)包含33 bp，3’非編碼區(qū)包含348 bp含有加尾信號(hào)（AATAAA），開(kāi)放閱讀框包含678 bp編碼225個(gè)氨基酸。CD79b的cDNA長(zhǎng)為801 bp，5’非編碼區(qū)包含165 bp，開(kāi)放閱讀框包含636 bp編碼211個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)結(jié)果表明兩者均由信號(hào)肽、免疫球蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和富含酪氨酸活化基序胞的質(zhì)區(qū)組成，同時(shí)，用于形成域內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基也非常保守。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示胭脂魚(yú)的CD79a和CD79b

5、分別與斑馬魚(yú)和鯉魚(yú)的CD79a和CD79b聚為一枝。
　　發(fā)育時(shí)期RT-PCR結(jié)果表明：CD79a和CD79b在胭脂魚(yú)的受精卵中即可檢測(cè)到，但表達(dá)量極其微弱，至出膜后30天左右的時(shí)候，CD79a和CD79b表達(dá)量趨于穩(wěn)定并逐漸增多。各組織RT-PCR結(jié)果表明：CD79a和CD79b在脾臟中表達(dá)量最高，頭腎、腎和外周血次之，心臟、鰓和肝中表達(dá)量較少，在腸、腦、皮膚和肌肉中未檢測(cè)到表達(dá)。滅活嗜水氣單胞菌刺激胭脂魚(yú)后，Q-PCR結(jié)果表明

6、：CD79a和CD79b在頭腎中的變化最顯著，在所有時(shí)間點(diǎn)都檢測(cè)到有上升趨勢(shì)，其中在48 h、72 h、96 h和7 d時(shí)表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05﹚。在脾臟中的變化趨勢(shì)較頭腎弱，CD79a和CD79b的表達(dá)量主要在48 h、72 h和96 h檢測(cè)到上調(diào)。在腎中的變化最弱，CD79a和CD79b主要在48 h、72 h、96 h和7 d檢測(cè)到有微弱的上調(diào)。
　　對(duì)外周血白細(xì)胞，脾臟、頭腎、腎、腸道、鰓和皮膚組織切片的原位雜交結(jié)

7、果顯示：少量CD79a，CD79b和IgM陽(yáng)性細(xì)胞在外周血中細(xì)胞可以檢測(cè)到。在脾臟、頭腎和腎中，CD79a，CD79b和IgM陽(yáng)性細(xì)胞較多，以分散或聚集的形式分布在整個(gè)器官中。在腸道中，CD79a、CD79b和IgM的分布有所差異，CD79a和CD79b陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在后腸的固有層中，少量分布于上皮細(xì)胞中，在前腸和中腸中未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。而IgM陽(yáng)性信號(hào)主要集中在前腸和中腸的固有層中，后腸固有層中較少。除此之外，IgM陽(yáng)性信號(hào)還可以在

8、后腸上皮層和中腸的漿膜層中檢測(cè)到表達(dá)。在鰓中，CD79a、CD79b和IgM陽(yáng)性信號(hào)主要在鰓上皮細(xì)胞中檢測(cè)到表達(dá)。在皮膚中未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。
　　通過(guò)原核表達(dá)載體PET-28a和PET-16b-GFP分別構(gòu)建了CD79a和CD79b重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化得到重組蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示：CD79a重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，分子量大小約為30 KDa， CD79b重組蛋白主要以分泌形式表達(dá)

9、，分子量大小約為55 KDa。分別以CD79a和CD79b重組蛋白作為抗原，免疫5-6周齡Balb/c雌性小鼠和新西蘭大白兔得到相應(yīng)抗血清，并通過(guò)細(xì)胞融合的方法制備了能分泌CD79a單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1-A5B1、1-D12H10和1-C5A4。Western blotting結(jié)果顯示：該抗體均可以與胭脂魚(yú)的頭腎提取液中分子量為25 KDa的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　本研究獲得胭脂魚(yú)CD79a全長(zhǎng)cDNA序列和CD