MAGe-A1和MAGe-A3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及機(jī)制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性神經(jīng)上皮性腫瘤,約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的45-50%,目前腦膠質(zhì)瘤治療方法有手術(shù)治療、放療和化療,但總的治療效果仍不理想,預(yù)后差。腫瘤免疫治療是一種針對性更強(qiáng)、副作用更小的治療,目前,它已經(jīng)成為繼腫瘤的手術(shù)治療、放射治療及化療之后的第四種腫瘤治療模式。腫瘤免疫治療的興起使得確立免疫治療理想靶點(diǎn),即,特異性腫瘤相關(guān)抗原,成為關(guān)鍵的前提,這要求腫瘤抗原具有以下特點(diǎn):抗原在腫瘤中高表達(dá),而在正常組織不表達(dá)或者表達(dá)具有

2、嚴(yán)格限制性。
   癌睪丸抗原(Cancer/testisantigen,CTA)在正常人體組織僅表達(dá)于睪丸生殖細(xì)胞和部分胎盤,而睪丸又被認(rèn)為是免疫豁免器官,因此,CTA被看做是腫瘤特異性免疫治療的理想靶點(diǎn)。黑色素瘤相關(guān)抗原基因(Melanoma-associatedantigengene-A,MAGE-A)是CTA的一個亞家族。近年來,因其具有更高的腫瘤特異性而成為研究熱點(diǎn)。
   近年來,導(dǎo)師的課題組一直致力于MAG

3、E-A基因的研究。本次研究首先采用免疫組織化學(xué)的方法觀察了MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織的表達(dá)情況及其與膠質(zhì)瘤臨床生物學(xué)指標(biāo)和預(yù)后之間的關(guān)系。應(yīng)用RT-PCR方法檢測MAGE-A1、MAGE-A3在mRNA水平的表達(dá),并通過MSP的方法分析了MAGE-A1、MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化情況與其基因表達(dá)的關(guān)系。在細(xì)胞水平給與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,DNMT

4、)抑制劑及組蛋白去乙?;福℉istonedeacetylase,HDAC)抑制劑,觀察細(xì)胞系在給藥前后MAGE-A1、MAGE-A3基因表達(dá)情況,分析表觀遺傳學(xué)機(jī)制在MAGE-A1和MAGE-A3表達(dá)中的作用。
   第一部分,MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及與膠質(zhì)瘤臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系
   目的:
   通過檢測MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11在腦膠質(zhì)瘤組織和

5、正常腦組織中的表達(dá)水平,研究三種蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床生物學(xué)指標(biāo)和預(yù)后之間的關(guān)系。
   方法:
   應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)水平,并分析三種抗原蛋白與膠質(zhì)瘤臨床生物學(xué)指標(biāo)(包括患者年齡、性別、臨床病理分級、KPS評分及ki-67指數(shù))之間的關(guān)系,且通過病例隨訪,分析MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)

6、后之間的關(guān)系。
   結(jié)果:
   1、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在正常睪丸組織中的表達(dá)
   在正常睪丸組織中,MAGE-A1主要位于初級精母細(xì)胞和精原細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜;MAGE-A3和-A11主要位于睪丸組織初級精母細(xì)胞和精原細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核。
   2、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)
   正常腦組織中,沒有MAGE-A1、-A3和-

7、A11蛋白的表達(dá)。MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)率(指的是2+~3+)分別為64.1%、51.2%和57.6%。MAGE-A1(P=0.000)和MAGE-A11(P=0.000)蛋白的表達(dá)在低級別膠質(zhì)瘤和高級別膠質(zhì)瘤之間有顯著性差異,且隨著病理級別的升高而增加,而MAGE-A3(P=0.958)蛋白則在各病理級別間沒有顯著性差異。在高級別腦膠質(zhì)瘤(Ⅲ~Ⅳ級),MAGE-A1蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿,而MA

8、GE-A3和MAGE-A11蛋白則主要表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿和胞核;在低級別腦膠質(zhì)瘤(Ⅰ~Ⅱ級),MAGE-A1蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜,而MAGE-A3和MAGE-A11蛋白則主要表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿和胞核。
   3、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)與臨床病例資料之間的關(guān)系
   MAGE-A1蛋白表達(dá)與患者的年齡(x2=1.651,P=0.199)、性別(x2=0.163,P=0.6

9、86)、KPS評分(x2=0.060,P=0.806)之間均無相關(guān)性,而與病理級別(x2=25.714,P=0.000)有顯著相關(guān)性,隨著病理級別的增高,MAGE-A1蛋白表達(dá)增加。
   MAGE-A3蛋白表達(dá)與患者的年齡(x2=0.195,P=0.658)、性別(x2=0.778,P=0.378)、病理級別(x2=0.159,P=0.690)之間均無相關(guān)性,而與KPS評分(x2=13.637,P=0.000)有顯著相關(guān)性。<

10、br>   MAGE-A11蛋白表達(dá)與患者的年齡(x2=0.382,P=0.537)、性別(x2=0.000,P=0.986)、KPS評分(x2=0.209,P=0.648)之間均無相關(guān)性,而與病理級別(x2=4.718,P=0.030)有顯著相關(guān)性,隨著病理級別的增高,MAGE-A11蛋白表達(dá)增加。
   4、MAGE-A1,-A3,-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)與ki-67指數(shù)(ki-67index,ki-67LI)之間的關(guān)

11、系
   MAGE-A1(x2=4.965,P=0.026)和MAGE-A11蛋白(x2=7.123,P=0.008)與ki-67LI有顯著相關(guān)性,而MAGE-A3(x2=2.224,P=0.136)則與ki-67LI無顯著相關(guān)性。
   5、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)與臨床預(yù)后之間的關(guān)系
   MAGE-A1和MAGE-A11蛋白高表達(dá)組的總生存期較MAGE-A1(P=0.005)和M

12、AGE-A11(P=0.019)低表達(dá)組短,差異有顯著性;MAGE-A3(P=0.304)高表達(dá)組總生存期與低表達(dá)組無顯著性差異。log-rank單因素分析顯示,病理級別、KPS評分、年齡、ki-67LI、MAGE-A1和MAGE-A11蛋白表達(dá)水平與患者的預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行Cox's回歸分析,得出病理級別、KPS評分、MAGE-A1和MAGE-A11蛋白表達(dá)水平與患者的預(yù)后相關(guān)。
   結(jié)論:
   1、MAGE-A

13、1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白具有相對的腫瘤特異性,可以作為理想的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。
   2、MAGE-A1和MAGE-A11可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。
   3、MAGE-A1、MAGE-A11蛋白、病理級別和KPS評分可以作為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)。
   第二部分,MAGE-A1和MAGE-A3在腦膠質(zhì)瘤中mRNA水平的表達(dá)及DNA甲基化狀態(tài)分析
   目的:
   檢測MAGE

14、-A1和MAGE-A3mRNA表達(dá)及MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),分析啟動子區(qū)甲基化與mRNA及蛋白表達(dá)的關(guān)系,并分析rnRNA表達(dá)及啟動子區(qū)甲基化與臨床病例特點(diǎn)之間的關(guān)系。
   方法:
   應(yīng)用RT-PCR的方法在腦膠質(zhì)瘤組織中檢測了MAGE-A1和MAGE-A3在mRNA水平的表達(dá),并分析它們蛋白表達(dá)及患者預(yù)后之間的關(guān)系,應(yīng)用MSP技術(shù)分析MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),分

15、析兩者的mRNA、蛋白表達(dá)與啟動子區(qū)甲基化之間的關(guān)系以及MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化與臨床生物學(xué)特征之間的關(guān)系。
   結(jié)果:
   1、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA在正常腦組織及膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)
   正常腦組織中均未發(fā)現(xiàn)MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達(dá)。膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達(dá)陽性率分別為65.4%和38.5%;兩者同時表達(dá)陽性的有21例,占

16、26.9%,僅有一個表達(dá)陽性的有60例,占76.9%,兩者都不表達(dá)的為18例,占23.1%。
   2、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者生存期之間的關(guān)系
   MAGE-A1mRNA陽性表達(dá)組的總生存期較陰性表達(dá)組短(P=0.046),差異有顯著性,MAGE-A3陽性表達(dá)組總生存期與陰性表達(dá)組之間無顯著性差異(P=0.797)。
   3、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表達(dá)與蛋白表

17、達(dá)之間的關(guān)系
   MAGE-A1(r=0.402,P=0.000)和MAGE-A3(r=0.242,P=0.033)的mRNA與蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān);但mRNA與蛋白的表達(dá)并非完全以一一對應(yīng)。
   4、MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)去甲基化狀態(tài)
   MAGE-A1基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的去甲基化率分別為0%(0/15)、64.1%(50/78),兩者之間差異有顯著性(x2=20.796,P=

18、0.000)。MAGE-A3基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的去甲基化率分別為0%(0/15)和41%(32/78),兩者之間差異有顯著性(x2=9.382,P=0.002)
   5、MAGE-A1和MAGE-A3基因的去甲基化狀態(tài)與它們的基因及蛋白表達(dá)之間的關(guān)系
   MAGE-A1基因啟動子區(qū)去甲基化的腦膠質(zhì)瘤組織其mRNA表達(dá)水平顯著高于發(fā)生甲基化的膠質(zhì)瘤組織(0.1414±0.0690vs.0.0317±0.00

19、66,P=0.000)。MAGE-A1基因啟動子區(qū)去甲基化與其在mRNA(x2=37.289,P=0.000)水平上的表達(dá)及在蛋白(x2=14.736,P=0.000)水平上的表達(dá)均有顯著的相關(guān)性。MAGE-A3基因啟動子區(qū)去甲基化的腦膠質(zhì)瘤組織其mRNA表達(dá)水平顯著高于發(fā)生甲基化的膠質(zhì)瘤組織(0.0666±0.0065vs.0.0071±0.0026,P=0.000)。MAGE-A3基因啟動子區(qū)去甲基化與MAGE-A3mRNA水平上的

20、表達(dá)有顯著的相關(guān)性(x2=36.066,P=0.000)而與其在蛋白水平上的表達(dá)無明顯的相關(guān)性(x2=1.697,P=0.193)。但MAGE-A1和MAGE-A3基因啟動子區(qū)的去甲基化與其mRNA表達(dá)之間并非完全一一對應(yīng)。
   6、MAGE-A1和MAGE-A3基因的去甲基化狀態(tài)與臨床生物學(xué)特征之間的關(guān)系
   MAGE-A1基因的去甲基化狀態(tài)與患者性別(x2=0.778,P=0.378)、KPS評分(x2=0.06

21、0,P=0.806)之間無顯著相關(guān)性,與年齡(x2=7.306,P=0.007)和病理級別(x2=14.286,P=0.003)有顯著相關(guān)性,低級別膠質(zhì)瘤MAGE-A1基因發(fā)生去甲基化頻率顯著低于高級別膠質(zhì)瘤。MAGE-A1啟動子區(qū)去甲基化組的總生存期較甲基化組短,但差異無顯著性(P=0.179)。MAGE-A3基因的去甲基化狀態(tài)與患者年齡(x2=0.1.009,P=0.315)、KPS評分(x2=0.102,P=0.749)、性別(x

22、2=0.464,P=0.496)及病理級別(x2=3.367,P=0.338)均無相關(guān)性。MAGE-A3啟動子區(qū)去甲基化組的總生存期較甲基化組短,但差異無顯著性(P=0.201)。
   結(jié)論:
   1、正常腦組織中無MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表達(dá),而在大部分膠質(zhì)瘤組織中有兩者的表達(dá),這表明兩者可以作為免疫治療的理想靶點(diǎn)。
   2、MAGE-A1的mRNA表達(dá)水平可以作為判斷臨床預(yù)后的一個指標(biāo)。

23、
   3、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平之間呈正相關(guān),但蛋白與mRNA的表達(dá)并不完全對應(yīng),蛋白表達(dá)高率于mRNA表達(dá)率,考慮與抗體在不同MAGE-A家族成員之間有交叉反應(yīng)所致。
   4、MAGE-A1和MAGE-A3基因在正常腦組織均無啟動子區(qū)去甲基化,而在大部分膠質(zhì)瘤組織存在啟動子區(qū)去甲基化。
   5、DNA去甲基化是MAGE-A1和MAGE-A3表達(dá)的機(jī)制之一,但是兩者表達(dá)

24、可能除此以外還有其他機(jī)制在起作用。
   6、MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)不能作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。
   第三部分,MAGE-A1和MAGE-A3在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的表達(dá)及DNA甲基化和組蛋白乙酰化狀態(tài)的檢測
   目的:
   對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251給予DNMT抑制劑:5-aza-CdR和HDAC抑制劑:TSA單獨(dú)或聯(lián)合刺激,觀察給藥前后MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表

25、達(dá)情況,以進(jìn)一步說明兩個基因表達(dá)的機(jī)制。
   方法:
   對兩種細(xì)胞分別給予5-aza-CdR濃度為0、2.5μmol/l、5μmol/l和/或TSA濃度為0、0.5μmol/l、1μmol/l藥物刺激72小時,然后,更換新鮮不含這兩種藥物的培基,培養(yǎng)48小時,收集細(xì)胞,提取RNA,以RT-PCR的方法檢測給藥刺激前后的MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達(dá)量。試驗(yàn)中,我們將5-aza-CdR濃度均為0μmol/

26、l,TSA濃度分別為0、0.5、1μmol/l的細(xì)胞定為第1~3組,5-aza-CdR為2.5μmol/l,TSA濃度分別為0、0.5、1μmol/l的細(xì)胞定為第4~6組,5-aza-CdR為5μmol/l,TSA濃度分別為0、0.5、1μmol/l的細(xì)胞定為第7~9組。
   結(jié)果:
   1、MAGE-A1和MAGE-A3在U87細(xì)胞和U251細(xì)胞的表達(dá)
   在未給與藥物處理時,U87細(xì)胞無MAGE-A1和

27、MAGE-A3的表達(dá),U251細(xì)胞有少量MAGE-A1(0.0553±0.001)和極少量MAGE-A3(0.0027±0.0003)表達(dá)。
   2、U87藥物處理后MAGE-A1和MAGE-A3的變化
   通過RT-PCR檢測MAGE-A1和MAGE-A3mRNA在U87的表達(dá)情況,在第1~3組中,兩個表達(dá)均為陰性,在第4~6組細(xì)胞中,兩者較第1~3組表達(dá)高,且隨著TSA濃度的增強(qiáng)逐漸增強(qiáng),在第7~9組細(xì)胞中,兩者

28、的表達(dá)較第4~6組高,且隨著TSA濃度的增強(qiáng)逐漸增強(qiáng)。析因分析,單用5-aza-CdR、單用TSA以及聯(lián)合應(yīng)用兩者后,MAGE-A1和MAGE-A3的表達(dá)之間均有顯著性差異,TSA三個不同濃度即0、0.5、1μmol/l及5-aza-CdR三個不同濃度即0、2.5、5μmol/l對兩個基因表達(dá)的影響之間均有顯著性差異,其中,5-aza-CdR濃度為5μmol/l聯(lián)合TSA濃度為1μmol/l,兩者表達(dá)量最高,這提示:在U87細(xì)胞單獨(dú)給予

29、HDAC抑制劑不能引起MAGE-A1和MAGE-A3基因的表達(dá)激活,單獨(dú)給予5-aza-CdR或與TSA合用可以引起兩個基因的表達(dá)激活,且兩者合用的作用好于單獨(dú)給藥,兩者有協(xié)同作用。
   3、U251藥物處理前后MAGE-A1和MAGE-A3的變化。
   在第1~3組,MAGE-A1和MAGE-A3均有少量表達(dá),在第4~6組細(xì)胞中,兩者的表達(dá)較第1~3組表達(dá)量高,且隨著TSA濃度的增高逐漸增強(qiáng),在第7~9組細(xì)胞中,兩

30、者的表達(dá)較第4~6組高,且隨著TSA濃度的增高逐漸增。析因分析顯示,單用5-aza-CdR、單用TSA以及聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物,兩者表達(dá)之間均有顯著性差異,其中,5-aza-CdR濃度為5μmol/l聯(lián)合TSA濃度為1μmol/l,兩者表達(dá)量最高,這提示:單獨(dú)給予HDAC抑制劑不能引起MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表達(dá)增加,單獨(dú)給予5-aza-CdR或與TSA合用可以引起MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達(dá)增加,且兩藥合用的

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