金黃色葡萄球菌PBP2a與松鼠葡萄球菌PBP4的功能相關(guān)性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是臨床上最常見的致病菌之一，能引起多種組織器官的嚴重感染。自1959年耐酶半合成青霉素甲氧西林應(yīng)用于臨床以來，很快就出現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），并迅速成為引起醫(yī)院和社區(qū)感染的主要致病菌。研究證實，MRSA對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制主要是由于葡萄球菌細胞膜表面的青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生變化所致，即MRSA獲得了外源性mecA基

2、因，該基因編碼產(chǎn)生一個額外的青霉素結(jié)合蛋白2a（penicillin-binding protein2a，PBP2a），其與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低。在β-內(nèi)酰胺類抗生素存在的條件下，宿主正常PBP被抑制，PBP2a可代替這些被抑制的PBP發(fā)揮生物催化功能，完成細菌細胞壁的生物合成，使細菌得以生存，故表現(xiàn)為對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。由于mecA僅存在于對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌，被認為是來源于相近種屬的外來遺傳物質(zhì)，經(jīng)變異進化成

3、MRSA的耐藥決定簇。在對β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感和耐藥的松鼠葡萄球菌中，普遍存在著一個與mecA高度相似的基因，即松鼠葡萄球pbpD，其編碼同樣與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低的松鼠葡萄球菌PBP4，目前已被接受為金黃色葡萄球菌mecA的遺傳學(xué)前體。雖然在基因水平和蛋白質(zhì)功能水平，MRSmecA與松鼠葡萄球pbpD高度相似，但不容忽視的是這兩個基因的核酸和蛋白序列仍具有明顯的差異。深入研究兩者間的差異，有助于對MRSA耐藥機制的進一步認識

4、和對mecA基因進化過程的全面了解。 目的: 本研究中，我們通過不同的葡萄球菌背景來觀察8個各具代表性的mecA/pbpD雜合子的表達，研究金黃色葡萄球菌PBP2a與松鼠葡萄球菌PBP4的功能性差異和相關(guān)性。試圖探明金黃色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD在導(dǎo)致甲氧西林耐藥中的作用，比較兩個基因在甲氧西林耐藥和支持細菌生長方面的效率。研究PBP2a與PBP4兩個功能性域在耐藥表型和細菌生長方面的遺傳學(xué)變化，以揭示金黃

5、色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD在nPB域和TPase域的差異，從而在功能域基礎(chǔ)上探究mecA基因的進化結(jié)果。 方法: 1.使用高保真PCR和分子克隆技術(shù)構(gòu)建mecA基因與pbpD基因雜合子（尤其構(gòu)建PBP2a與PBP4 nPB：TPase雜合子），通過電穿孔術(shù)和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)金黃色葡萄球菌細胞。 2.構(gòu)建不同的啟動子：mecA/pbpD雜合子，包括：不同啟動子控制的金黃色葡萄球菌mecA

6、和松鼠葡萄球菌pbpD，以及在同一啟動子控制下的金黃色葡萄球菌mecA、松鼠葡萄球菌pbpD和nPB：TPase雜合子；目的是在已知的可比較條件下觀察這些基因的表達。 3.提取細菌RNA，通過Northern blot在轉(zhuǎn)錄水平對成功構(gòu)建重組mecA與pbpD區(qū)進行證實，并研究這些基因的表達。 4.制備細菌膜蛋白，應(yīng)用ECL Western blotting analysis system進行Western blotti

7、ng分析，在蛋白水平對成功構(gòu)建重組mecA與pbpD區(qū)進行證實，并研究這些基因的表達。 5.對攜帶不同重組質(zhì)粒的菌株RU4轉(zhuǎn)導(dǎo)體進行在抗生素作用下的菌群譜分析，觀察攜帶重組質(zhì)粒的菌株COLmec-和COLmec-spac：：pbpB對抗生素的敏感性，以獲得這些攜帶重組mecA/pbpD質(zhì)粒菌株詳實的耐藥表型。 6.測定細菌生長曲線，觀察攜帶重組質(zhì)粒的COLmec-pbpB基因缺陷突變株COLmec-spac：：pbpB的

8、生長情況，以闡明不同mecA/pbpD雜合子對宿主菌生長的支持作用。 結(jié)果: 1.本研究中，按特定目的成功構(gòu)建了8個重組質(zhì)粒，被置于幾種特定的金黃色葡萄球菌背景下，觀察金黃色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD在不同和相同轉(zhuǎn)錄水平的表達；比較了金黃色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD雜合子與其前體在相同轉(zhuǎn)錄水平的表達；探討了mecA和pbpD基因中結(jié)構(gòu)域的不同以及外源基因mecA和宿主固有基因pbpB之間的關(guān)系。

9、 2. Northern blot在RNA水平對成功構(gòu)建重組mecA與pbpD區(qū)進行分析，發(fā)現(xiàn)代表各mecA/pbpD基因的轉(zhuǎn)錄子與相應(yīng)的mRNA理論值符合；pSTSW6和pSTSW13攜帶的mecA/pbpD基因轉(zhuǎn)錄水平極低；pSTSW8和pSTSW8a，pSTSW14和pSTSW14a攜帶的基因在高水平轉(zhuǎn)錄；而pSTSW2C和p37MA在最高的水平表達。 3. Western blotting與Northern blo

10、t結(jié)果相符，而且PBP2a蛋白分子量大小主要與nPB域相關(guān)。 4.僅有高表達的金黃色葡萄球菌mecA基因和松鼠葡萄球菌pbpD基因在沒有宿主PBP2時能支持細菌生長和導(dǎo)致甲氧西林耐藥，而其他的雜合子表達需要PBP2的存在。此外，金黃色葡萄球菌mecA比松鼠葡萄球菌pbpD更易導(dǎo)致耐藥；原始的mecA基因比替換nPB域的雜合子更易導(dǎo)致耐藥。 5.金黃色葡萄球菌mecA與松鼠葡萄球菌pbpD在耐藥和支持細菌生長方面有高度的相

11、似性，而前者更有效。nPB域在mecA基因進化過程中比TPase域更活躍，從而使金黃色葡萄球菌mecA產(chǎn)物功能結(jié)構(gòu)最優(yōu)化。 結(jié)論: 1.當金黃色葡萄球菌mecA、松鼠葡萄球菌pbpD和兩者的雜合子在低和中等水平表達時，它們的生物功能完全依賴于功能性pbpB基因表達的存在；而宿主PBP2的生物學(xué)功能，僅可被過度表達的金黃色葡萄球菌PBP2a和松鼠葡萄球菌PBP4替代。 2.mecA與pbpD基因產(chǎn)物的生物活性有賴于

12、氨基酸組成的完整性和酶活性位點形成的正確性，并不由孤立的功能域所決定。 3.由看家基因松鼠葡萄球菌pbpD至耐藥決定簇金黃色葡萄球菌mecA，經(jīng)歷了nPB和TPase兩個功能域協(xié)同進化的過程。 4.盡管不能證明金黃色葡萄球菌PBP2a和松鼠葡萄球菌PBP4具有TGase活性，在苯唑西林存在時兩者仍能“獨立”的行使支持細菌生長和介導(dǎo)抗生素耐藥性的功能。 5.抗生素壓力和其它環(huán)境因素選擇出最適的變異體以保障子代的生存