HCV E2蛋白促進(jìn)B淋巴細(xì)胞活化和增殖的機(jī)制及E2蛋白突變體免疫原性分析.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是帶有包膜的正鏈RNA病毒，主要經(jīng)血液傳播，引起急、慢性丙型肝炎，并可導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌。HCV感染除引起肝臟病變外，還可引起多種肝臟外組織損害，與B細(xì)胞淋巴瘤、冷球蛋白血癥等多種肝外疾病有關(guān)。目前全球HCV感染者約有1.7億，HCV感染的慢性率高達(dá)80％。HCV的基因變異，對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)免疫的拮抗作用以及相對(duì)低水平表達(dá)和復(fù)制等均與HCV慢性感染有關(guān)。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，HCV包

2、膜E2蛋白與CD81分子結(jié)合所致免疫細(xì)胞的功能紊亂也可能是HCV慢性感染的重要原因，并且與B細(xì)胞淋巴瘤以及冷球蛋白血癥具有重要相關(guān)性。HCV包膜E2蛋白的CD81結(jié)合活性還可能與HCV感染難以誘導(dǎo)中和抗體而導(dǎo)致慢性感染有關(guān)。 一、HCV包膜蛋白E2促進(jìn)B淋巴細(xì)胞活化和增殖的作用機(jī)制 HCV包膜E2蛋白通過與B淋巴細(xì)胞表面上CD81分子的作用，改變了B細(xì)胞激活的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞非特異性活化。我們構(gòu)建了HCV

3、包膜E2蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)HCVE2蛋白。將表達(dá)的E2蛋白固定在事先包被了E2單抗的酶標(biāo)微孔板上，然后加入Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞，可觀察到該細(xì)胞聚集貼附生長(zhǎng)。然而用siRNA下調(diào)Raiji細(xì)胞表面CD81的表達(dá)，則不能使Raji細(xì)胞聚集貼附生長(zhǎng)，說明表達(dá)的E2蛋白能夠與Raji細(xì)胞表面的CD81分子結(jié)合。進(jìn)一步我們制備固定化的E2蛋白，并分別用固定化的E2和可溶性E2蛋白刺激Raji細(xì)胞，然后分析細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸

4、化的水平。結(jié)果表明，固相化的E2蛋白可有效上調(diào)Raji細(xì)胞內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸化的水平，而可溶性E2對(duì)Raji細(xì)胞內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸化水平則無明顯影響。這可能是因?yàn)楣滔嗷腅2蛋白類似天然的病毒顆粒，在構(gòu)象上要更接近于天然的病毒顆粒表面E2蛋白，而且固相化后的E2蛋白在單位體積的密度要高于可溶性的E2蛋白單位體積的密度，使其能夠更充分的與細(xì)胞表面的CD81分子相互接觸作用。 構(gòu)建CD81分子siRNA的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

5、包裝出病毒后感染Raji細(xì)胞，流式檢測(cè)：Raji細(xì)胞表面CD81分子表達(dá)被抑制，進(jìn)一步用固相化的E2蛋白刺激該CD81表達(dá)下調(diào)的Raji細(xì)胞，則觀察到Raji細(xì)胞內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸化水平無明顯的變化，這說明E2蛋白對(duì)Raji細(xì)胞的信號(hào)調(diào)節(jié)是經(jīng)由CD81分子作用的。固相化的E2蛋白刺激Raji細(xì)胞后用western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，可以觀察到Bcl-2蛋白表達(dá)下降，而Bax蛋白表達(dá)增

6、加。Bcl-2基因是人體最主要的抗凋亡基因，它編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物定位于線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上，其主要生物學(xué)功能是延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，增加細(xì)胞對(duì)各種凋亡刺激因素的抵抗力．它可導(dǎo)致DNA受損的細(xì)胞持續(xù)生存，突變產(chǎn)物聚集，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)具有加速細(xì)胞凋亡的功能，Bax可與抗凋亡基因Bcl-2形成異源二聚體，具有抑制Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax兩者之間的比例決定了細(xì)胞的命運(yùn)，若Bax

7、占多數(shù)，則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導(dǎo)，細(xì)胞死亡；反之則Bax受到抑制，細(xì)胞得以生存。E2蛋白刺激Raji細(xì)胞后促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)而抑制Bax的表達(dá)，這說明E2蛋白能夠增強(qiáng)Raji細(xì)胞的抗凋亡能力。E2蛋白能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞蛋白酪氨發(fā)生酸磷酸化且促進(jìn)B細(xì)胞的抗凋亡的能力，這些可能是E2促進(jìn)B細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)固相化HCV E2蛋白刺激的Raji細(xì)胞表面CD80、CD86和CD21分子的表達(dá)，結(jié)果可看到CD80和CD86

8、分子的表達(dá)上調(diào)，而CD21分子的表達(dá)下降，CD80、CD86和CD21是與B淋巴細(xì)胞的活化緊密相關(guān)的膜表面分子，這說明E2蛋白能刺激Raji細(xì)胞的活化，從而也促進(jìn)Raji細(xì)胞的增殖。 二、HCV E2蛋白突變體免疫原性分析 研究表明HCV包膜E2蛋白可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸化，通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)而促進(jìn)B淋巴瘤細(xì)胞的增殖，并且還能上調(diào)活化分子的表達(dá)，說明E2蛋白能通過激活胞

9、內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。而E2對(duì)B細(xì)胞的激活可能導(dǎo)致HCV感染難以有效誘導(dǎo)中和抗體，因此，消除E2蛋白的CD81結(jié)合活性可能有利于中和抗體的誘導(dǎo)。 我們分別將H77株的E2蛋白的第442位苯丙氨酸(F)和529位的色氨酸(W)突變?yōu)楸彼?A)，構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用E2多抗對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清以及細(xì)胞裂解液中的E2蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明突變對(duì)E2的表達(dá)和分泌無明顯影響。用ELISA分析兩種突變的E2蛋白與大腸桿菌表達(dá)的

10、Trx(硫氧還蛋白)-CD81 LEL(大胞外環(huán))融合蛋白的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，該兩個(gè)位點(diǎn)的突變體不再具有與CD81大胞外環(huán)(LEL)的結(jié)合活性；進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析兩種E2突變體與表達(dá)CD81分子的CHO細(xì)胞結(jié)合情況表明，該兩個(gè)位點(diǎn)突變的E2蛋白不再具有與膜表面的CD81分子結(jié)合的功能。用突變體質(zhì)粒E2-W529/A和E2-W442/A轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，免疫熒光檢測(cè)兩株構(gòu)象依賴性單抗與突變體E2蛋白的反應(yīng)，結(jié)果表明，該兩個(gè)位點(diǎn)

11、的突變對(duì)E2蛋白空間構(gòu)象無明顯影響。將固相化的兩種突變體E2蛋白分別刺激Raji細(xì)胞，沒有檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水平發(fā)生明顯變化，這表明，消除CD81結(jié)合活性可消除E2蛋白對(duì)Raji細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活作用。 HCV E2蛋白第442和529位氨基酸分別位于兩個(gè)線性B細(xì)胞表位中，其中，前者所在表位抗體具有中和活性，而后者病毒中和活性并不明顯。因此，選擇529位的突變體進(jìn)行免疫可有利于保留更多的中和抗體表位。我們將野生E

12、2與突變體E2-W529/A表達(dá)質(zhì)粒分別免疫小鼠，眼眶取血收集免疫小鼠的血清，分別用野生和突變的E2蛋白為靶抗原檢測(cè)小鼠的抗體動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明，兩種DNA免疫小鼠血清的E2抗體動(dòng)力學(xué)水平相似，這說明W529/A突變對(duì)于E2蛋白的免疫原性無明顯影響。524～531位氨基酸殘基APTYSWGA為一線性B細(xì)胞表位，其抗體能抑制E2蛋白與CD81的結(jié)合。我們將該表位與紅色熒光蛋白融合，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用免疫熒光分析該表位與小鼠血清的結(jié)合，

13、結(jié)果表明，W529A的突變部分降低了該表位的免疫原性/抗原性。AP33表位為HCV E2蛋白第412～423位氨基酸殘基QLINTNGSWHIN，也為一線性B細(xì)胞表位，其在HCV的六個(gè)基因型中高度保守，AP33能有效中和HCV的感染性。同樣構(gòu)建該表位與紅色熒光蛋白R(shí)FP融合表達(dá)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用免疫熒光分析其與小鼠血清的結(jié)合表明，W529/A突變不影響該表位的抗體應(yīng)答，野生或突變E2均可誘導(dǎo)針對(duì)該表位的抗體。構(gòu)建11株HCV(涵蓋6個(gè)基

14、因型)包膜E2蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用免疫熒光分析小鼠免疫血清與這些不同株不同基因型E2蛋白的反應(yīng)，結(jié)果表明，E2-W529/A免疫血清可與該11株HCV包膜蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。為了評(píng)價(jià)免疫血清的中和作用，我們構(gòu)建了五株HCV包膜蛋白的HCVpp進(jìn)行中和試驗(yàn)。從結(jié)果可見，野生型E2以及E2-W529/A突變體免疫血清均可有效中和這八株HCVpp對(duì)靶細(xì)胞Huh7.5的感染性，且對(duì)同株HCVpp的中和效率無明顯差異。進(jìn)一步我們用JHF-1株

15、HCVcc評(píng)價(jià)小鼠血清的中和作用，結(jié)果表明兩種質(zhì)粒免疫血清均可抑制HCVcc的感染性，抑制效率相似。 三、小結(jié) 1．本研究中用固相化的HCV包膜蛋白E2刺激人B淋巴細(xì)胞Raji細(xì)胞，可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)的蛋白酪氨酸的磷酸化，而用siRNA．干擾掉B細(xì)胞表面CD81的表達(dá)后用E2蛋白再刺激Raji細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化的水平未發(fā)生明顯的變化。而且E2蛋白刺激Raji細(xì)胞可上調(diào)Raji細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)

16、，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)膜表面CD80、CD86分子的表達(dá)，下調(diào)膜表面CD21分子的表達(dá)。這些結(jié)果表明HCV包膜蛋白E2可通過與CD81分子作用改變B淋巴細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起的B細(xì)胞的增殖和非特異性激活。 2．在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了一種E2蛋白突變體，將第529位色氨酸突變?yōu)楸彼幔揥529/A突變體不影響E2蛋白的空間構(gòu)象，但是消除了與CD81的結(jié)合活性。該突變體刺激B淋巴細(xì)胞后，對(duì)B細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化水