CpG-ODN對(duì)兩種病原菌聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性乳腺炎保護(hù)作用的研究.pdf

1、本文通過(guò)建立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠)模型，探討了同時(shí)采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌人工誘發(fā)乳腺炎時(shí)，大鼠乳腺局部及整個(gè)機(jī)體免疫功能的變化；并通過(guò)給大鼠注射免疫增強(qiáng)劑CpG-ODN，探索其在大鼠發(fā)生實(shí)驗(yàn)性乳腺炎時(shí)，對(duì)乳腺局部免疫和機(jī)體免疫功能的影響。 1．兩種病原菌聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性乳腺炎的研究 18只飼喂基礎(chǔ)日糧的泌乳初期SD雌性大鼠隨機(jī)分成三組(n=6)，產(chǎn)后72h分別用滅茵0.01 mol·L<'-1>，pH 7.2 PBS

2、(CON組)、低濃度組(金黃色葡萄球茵和大腸桿菌在混懸液中的濃度都為1×10<'5> CFU·mL<'-1>，L組)和高濃度(金黃色葡萄球茵和大腸桿茵在混懸液中的濃度都為1×10<'12> CFU·mL<'-1>，H組)，經(jīng)乳頭管灌注到大鼠第四對(duì)乳腺內(nèi)，灌注后24 h頸靜脈放血處死。取部分乳腺組織進(jìn)行組織學(xué)觀察。低濃度(L組)乳腺的病變主要以腺泡上皮發(fā)生輕度的脂肪變性，腺泡腔的分泌物中有透明滴狀物為主要特征，高濃度(H組)的乳腺腺泡結(jié)構(gòu)

3、破壞嚴(yán)重，腺泡中有較多的嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組乳腺和血清IL-1 β水平較對(duì)照組均有所升高，其中H組乳腺和血清IL-1 β水平分別極顯著（P<0.01)和顯著(P<0.05)高于對(duì)照組。L組乳腺和血清IL-6水平較對(duì)照組均有所升高，但差異不顯著，H組乳腺I(mǎi)L-6則有顯著(P<0.05)下降，H組血清IL-6水平則極顯著(P<0.01)低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組組乳腺TNF-α水平均高于對(duì)照組，其中L組升高差異不顯著，H組乳腺則極顯著高于對(duì)照組

4、(P<0.01)，血清TNF-α水平均下降，其中L組下降差異不顯著，H組則極顯著(P<0.01)低于對(duì)照組．實(shí)驗(yàn)組乳腺NAGase活性均高于對(duì)照組，其中H組極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組血清NAGase活性均低于對(duì)照組，其中H組極顯著(P<0.01)下降．H組乳腺和血清MPO活力均顯著(P<0.05)高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組乳腺白蛋白含量均高于對(duì)照組，其中H組乳腺白蛋白顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，L組血清白蛋白含量高于對(duì)照組，H

5、組血清白蛋白顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。由上述結(jié)果可知高低濃度的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠乳腺炎模型均已成功建立。 2．CpG-ODN對(duì)兩種細(xì)菌聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性乳腺炎的作用研究 72只泌乳期SD雌性大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(n=36)，對(duì)照組于產(chǎn)后Oh左后腿脛骨前肌內(nèi)注射滅菌100 μl0.01molL<'-1> pH7.2，PBS；實(shí)驗(yàn)組肌注CpG-ODN 200μg/只，產(chǎn)后72h經(jīng)乳頭管灌注金

6、黃色葡萄球菌和大腸桿菌的混懸液(兩種細(xì)茵在混懸液中的濃度均為1×10<'12>CFU·mL<'-1>)100μ1/側(cè)到第四對(duì)乳腺(雙側(cè))內(nèi)。分別于灌注前0h，灌注后8、16、24、48、72 h(n=6)頸靜脈放血處死。組織學(xué)觀察顯示對(duì)照組灌注前Oh乳腺組織無(wú)明顯病理變化，灌注后8h腺泡內(nèi)開(kāi)始即有大量PMN浸潤(rùn)，48h達(dá)到浸潤(rùn)高峰，72h仍有少量浸潤(rùn)。乳腺組織IL-2水平在感染后有下降趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組IL-2均低于Oh(P＜0.01)，在8

7、h迅速降至最低點(diǎn)，然后緩慢回升。對(duì)照組16h達(dá)到最低且差異顯著。實(shí)驗(yàn)組乳腺組織IL-2水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均極顯著(P＜0.01)高于對(duì)照組。血清IL-2在感染后緩慢下降，對(duì)照組在48h下降至最低，實(shí)驗(yàn)組在8-48h保持在較低水平，但兩組差異均不顯著。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組乳腺組織IL-6水平在感染后有上升趨勢(shì)且差異極顯著，48h達(dá)到高峰；CpG-ODN能提高乳腺組織IL-6水平。血清IL-6在感染后呈下降趨勢(shì)但差異不顯著，但在72h實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組

8、顯著上升，實(shí)驗(yàn)組在8-24h變化緩慢且保持在較低水平，且在24h下降至最低。TNF-α在48h達(dá)最高，CpG-ODN能顯著提高48h乳腺組織TNF-α水平。兩組乳腺組織MPO水平均在24h上升至最高。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組MPO水平在0h，8h，24h有顯著上升。乳腺組織NAGase在48h上升至最高，血清中48h下降至最低。CpG-ODN能顯著降低48h乳腺組織NAGasc活力。上述結(jié)果顯示CpG-ODN可促進(jìn)炎癥初期嗜中性粒細(xì)胞的快速

9、浸潤(rùn)，促進(jìn)并加速細(xì)胞因子的產(chǎn)生及釋放，減少乳腺組織細(xì)菌數(shù)量，減輕炎癥介質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷，提示CpG-ODN對(duì)同時(shí)由金葡茵和大腸桿菌誘發(fā)感染的大鼠乳腺炎有一定的保護(hù)作用。3.CpG-ODN對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性乳腺炎的作用機(jī)理初探本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建優(yōu)化的半定量RT-PCR法，以β-actin為內(nèi)參，研究CpG-ODN對(duì)大鼠乳腺炎模型的乳腺組織中TLR-9 mRNA基因表達(dá)水平的影響。提取大鼠乳腺組織總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增，先尋求PCR線性擴(kuò)增范圍，

10、確定RT-PCR的最佳循環(huán)數(shù)和最適反應(yīng)條件，最終建立了一個(gè)穩(wěn)定、方便的半定量RT-PCR體系。PCR擴(kuò)增后掃描擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶灰度。通過(guò)TIR-9 mRNA產(chǎn)物的灰度與β-actin mRNA產(chǎn)物的灰度之比，得出相對(duì)含量．TLR-9可以介導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞對(duì)CpG序列的應(yīng)答，結(jié)果顯示CpG-ODN能顯著提高乳腺組織中其特異性受體TLR-9 mRNA表達(dá)水平，從而通過(guò)TLR-9水平的上調(diào)提高免疫細(xì)胞上的細(xì)胞因子的釋放水平，以增強(qiáng)機(jī)體的免