YajQ家族c-Di-GMP受體蛋白XC3703、Smlt4090及根癌農(nóng)桿菌T6SS銜接蛋白Atu4349結(jié)構(gòu)及功能的研究.pdf

1、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的致病菌。Xcc能夠在世界范圍內(nèi)感染十字花科植物，從而在種植此類作物的地區(qū)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）是一種較為罕見的革蘭氏陰性條件致病菌，易引起免疫力低下個(gè)體出現(xiàn)感染癥狀。c-di-GMP是一種廣為人知的胞內(nèi)第二信使，參與細(xì)菌包括生物被

2、膜合成、細(xì)菌毒力、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等多種重要生理功能。而c-di-GMP的功能是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)存在的c-di-GMP受體實(shí)現(xiàn)的。c-di-GMP通過(guò)與受體相互作用而引起下游相應(yīng)生理生化功能變化從而行使其功能。
　　近期有研究報(bào)道YajQ蛋白家族成員中存在一種新型的c-di-GMP受體。YajQ家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)菌中相對(duì)保守，具有潛在的與核酸結(jié)合的能力。而Xcc中的YajQ家族成員XC3703被證明能與轉(zhuǎn)錄因子XC2801發(fā)生相互作用，而其

3、與c-di-GMP的結(jié)合能夠逆轉(zhuǎn)這種相互作用，從而影響下游基因的表達(dá)，影響包括生物被膜形成、細(xì)菌毒力等在內(nèi)的多種重要生物學(xué)功能。而S.maltophilia中的同家族成員Smlt4090被證明也有結(jié)合c-di-GMP的能力，該蛋白的突變菌株生物被膜形成量及對(duì)侵染對(duì)象的吸附性明顯降低。在本論文的第一部分中，主要內(nèi)容為XC3703及Smlt4090結(jié)構(gòu)與功能的研究。
　　XC3703及Smlt4090氨基酸序列比對(duì)相似度高達(dá)83％。在

4、此論文中，我們成功解析得到了XC3703及Smlt4090的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但是遺憾的是并未獲得二者與c-di-GMP形成的復(fù)合物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在解析獲得的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，XC3703每個(gè)不對(duì)稱單位中包含兩個(gè)蛋白質(zhì)分子，但隨后的分析柱實(shí)驗(yàn)證明其在溶液狀態(tài)中以單體形式存在。而在Smlt4090結(jié)構(gòu)中，每個(gè)不對(duì)稱單位中包含三個(gè)蛋白質(zhì)分子，分析柱實(shí)驗(yàn)同樣證明其在溶液狀態(tài)中以單體形式存在。另外，結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果顯示，二者結(jié)構(gòu)相似度高達(dá)81％，
　　

5、根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是引發(fā)植物冠癭病的病原菌，能夠使植物形成冠癭瘤。另外，由于該菌基因組中的Ti質(zhì)粒，其在植物遺傳操作中有重要應(yīng)用。細(xì)菌六型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system，T6SS)是近年來(lái)備受關(guān)注的一種細(xì)菌分泌系統(tǒng)。T6SS是一種功能與結(jié)構(gòu)上皆類似于倒置的噬菌體尾部的注射器狀分泌裝置，能夠通過(guò)將多種效應(yīng)蛋白注射至相鄰原核或真核細(xì)胞中取得競(jìng)爭(zhēng)或生存優(yōu)勢(shì)。而近期的實(shí)

6、驗(yàn)證明，效應(yīng)蛋白的有效輸出需要同宗銜接蛋白的參與。銜接蛋白能與相應(yīng)效應(yīng)蛋白及注射裝置組成部分VgrG蛋白形成復(fù)合物，從而幫助效應(yīng)蛋白分泌。銜接蛋白基因敲除后細(xì)菌毒力明顯下降。在本論文的第二部分中，主要內(nèi)容為根癌土壤桿菌中銜接蛋白Tap-1蛋白質(zhì)純化及結(jié)晶條件的研究。
　　在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用大腸桿菌BL21細(xì)胞表達(dá)得到的Tap-1蛋白無(wú)法得到蛋白晶體?？紤]到Tap-1中有三個(gè)半胱氨酸，晶體生長(zhǎng)可能受二硫鍵影響。因此在實(shí)驗(yàn)中除片段