PCR-SSP方法研究武漢人群HLA-A-02多態(tài)性及其常見亞型基因的克隆.pdf

1、HLA-A*02不同亞型在提呈抗原肽及T細胞識別方面的功能差異一直是研究的熱點，而且在臨床器官移植過程中HLA-A*02亞型不匹配引起的強烈的同種反應也越來越受到重視。因此在腫瘤免疫學方法治療、同種反應研究中常需要對HLA-A*02亞型及其功能加以分析。
　　 為了進一步研究HLA-A*02不同亞型在提呈抗原肽及T細胞識別方面的功能，我們建立了一種通過19條引物組成的15對特異引物組合，能夠快速檢測出17個HLA-A*02亞型巢

2、式聚合酶鏈反應-序列特異性引物（PCR-SSP）HLA-A*02等位基因分型方法，并調查了該等位基因在武漢人群的分布情況。同時在檢測亞型的基礎上克隆了HLA-A*0206基因及構建了HLA-A*0207真核表達載體，本研究主要內容如下：
　　 目的：①建立一種能簡易、快速檢測出HLA-A*02亞型分型方法及調查武漢地區(qū)人群該等位基因的分布；②克隆HLA-A*0206基因，并構建HLA-A*0207真核表達載體。
　　 方

3、法：①本研究從武漢健康志愿者獻血人員中經第一輪PCR篩選HLA-A*02陽性個體，然后通過具有較高特異性第二輪PCR-SSP進行HLA-A*02亞型等位基因分析。此外，由于A*0209和A*0215N的多態(tài)性位點在第四外顯子，第一輪PCR即可進行亞型分型，不需兩輪PCR分型。②為了驗證我們方法的可靠性，采用T2細胞（A*0201）作為陽性對照，取部分標本用抗HLA-A*02特異性單抗BB7.2進行血清學流式細胞（FACS）檢測，并送PC

4、R產物進行測序。③根據亞型分型結果，采用RT-PCR方法克隆HLA-A*0206基因，并構建HLA-A*0207真核表達載體，挑取單克隆細菌進行擴增，提取質粒酶切、測序鑒定。
　　 結果：①從154例武漢健康志愿者獻血人員中經第一輪PCR篩選78例HLA-A*02陽性個體，血清學FACS檢測檢測結果也都為陽性；②從HLA-A*02陽性個體中共檢測到5個A*02等位基因，其中A*0201基因頻率最高（15.7%）；其余依次為A*0

5、207 (5.8%)，A*0206 (4.7%)，A*0203 (2.6%)，A*0210(0.7%)；亞型特異性PCR-SSP分型的結果與測序分析結果也完全一致；③克隆的HLA-A*0206基因及構建的HLA-A*0207真核表達載體，分別挑單克隆測序結果均與Genebank提供序列一致，說明HLA-A*0206基因克隆及HLA-A*0207真核表達載體構建成功。
　　 結論：我們成功地建立了一種能簡易快速地檢測出占有A*02

6、頻率99%以上17種亞型的巢式PCR-SSP分型方法，通過該方法檢測到武漢地區(qū)HLA-A*02分布具有高度多態(tài)性,其中A*0201基因頻率最高（15.7%）；其余依次為A*0207 (5.8%)，A*0206 (4.7%)，A*0203 (2.6%)，A*0210(0.7%)。在分型的基礎上克隆了包含兩端部分非編碼區(qū)（UTR）的HLA-A*0206等位基因及成功構建了HLA-A*0207真核表達載體，為進一步研究HLA-A*02各亞型功