TIPE2通過IRF4調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、目的:研究TLR信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)因子TIPE2在胃炎到胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能，并研究TIPE2通過誘導(dǎo)調(diào)控IRF4抑制胃上皮細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，從而為胃癌疾病的發(fā)生發(fā)展提供了新線索。
　　方法:1.組織水平上，以免疫組織化學(xué)方法檢查不同程度胃炎組織，胃癌組織中TIPE2蛋白表達(dá)情況。同時(shí)提取組織的RNA，通過qRT-PCR方法檢測(cè)mRNA水平上TIPE2的表達(dá);提取TIPE2基因敲除小鼠肝、腎、小腸、心臟、胃等器官組織的RNA，利用

2、Western blot方法檢測(cè)蛋白水平上IRF4表達(dá)，同時(shí)通過qRT-PCR方法檢測(cè)mRNA水平上IRF4的表達(dá)情況。
　　2.細(xì)胞水平上，通過轉(zhuǎn)染人TIPE2高表達(dá)的質(zhì)粒pRK5-tipe2進(jìn)入胃上皮細(xì)胞系，使得細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)TIPE2，檢測(cè)TIPE2在胃癌上皮細(xì)胞增殖中的作用:
　　(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將人TIPE2高表達(dá)質(zhì)粒pRK5-tipe2及其對(duì)照質(zhì)粒pRK5-mock轉(zhuǎn)染胃上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS，分別于48小時(shí)、72小時(shí)后

3、收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白質(zhì)。通過Western blot和qRT-PCR分別在蛋白水平和mRNA水平檢測(cè)TIPE2的表達(dá)，并評(píng)估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率。
　　(2)細(xì)胞增殖能力檢測(cè):以2u g、4ug、8ug的濃度梯度轉(zhuǎn)染TIPE2表達(dá)質(zhì)粒pRK5-tipe2以及對(duì)照質(zhì)粒pRK5-mock進(jìn)入AGS細(xì)胞，于48小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔300個(gè)細(xì)胞的比例加入六孔板中，培養(yǎng)至形成肉眼可見的克隆群落，比較兩組的差異。
　　(3)研究TI

4、PE2對(duì)細(xì)胞周期的影響:TIPE2表達(dá)質(zhì)粒pRK5-tipe2和pRK5-mock對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)入AGS細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，以流式細(xì)胞術(shù)分析這些細(xì)胞所處周期的變化。
　　(4)生物芯片分析TIPE2抑制增殖可能的分子機(jī)制:AGS細(xì)胞在轉(zhuǎn)染TIPE2高表達(dá)質(zhì)粒后，進(jìn)行表達(dá)譜生物芯片分析，并以Western blot和qRT-PCR方法對(duì)顯著變化的靶基因機(jī)器通路相關(guān)分子在蛋白和mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證。
　　(5)小干擾R

5、NA轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染TIPE2表達(dá)質(zhì)粒pRK5-tipe2和pRK5-mock對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)入AGS細(xì)胞，24小時(shí)后部分AGS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染小干擾IRF4 RNA，48小時(shí)后，收集蛋白及提取RNA，并以Western blot和qRT-PCR方法檢測(cè)IRF4蛋白和mRNA水平，同時(shí)也檢測(cè)TIPE2蛋白與mRNA水平驗(yàn)證基因敲減效率。
　　(6)通路抑制劑:對(duì)AGS細(xì)胞系分別加入不同信號(hào)通路特有的抑制劑，72小時(shí)后收集蛋白質(zhì)檢測(cè)蛋白水平IRF4

6、的變化，判斷TIPE2用以調(diào)節(jié)IRF4的信號(hào)通路。
　　結(jié)果:1.免疫組化結(jié)果顯示TIPE2在胃部的正常組織高表達(dá)，但在胃部慢性炎癥組織中表達(dá)降低而且與炎癥的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，在胃癌組織中無表達(dá);并且qRT-PCR在mRNA水平驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果，證明在胃部疾病發(fā)生發(fā)展時(shí)TIPE2表達(dá)發(fā)生變化并且隨疾病的進(jìn)展程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　2.胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染TIPE2表達(dá)質(zhì)粒后，在蛋白質(zhì)水平上TIPE2表達(dá)量明顯升高;同時(shí)能夠檢測(cè)到

7、細(xì)胞克隆形成能力明顯受到抑制。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示TIPE2過表達(dá)能夠抑制S期細(xì)胞的比例，使細(xì)胞停留在G1期，表明TIPE2通過抑制細(xì)胞進(jìn)入S期而抑制上皮細(xì)胞增殖。
　　4.生物基因芯片以及蛋白質(zhì)分析結(jié)果表明，IFR4表達(dá)水平與TIPE2轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)劑量依賴性;敲除TIPE2基因的小鼠器官組織內(nèi)IRF4表達(dá)下調(diào)。
　　5.通過轉(zhuǎn)染IRF4小干擾RNA進(jìn)一步驗(yàn)證TIPE2是通過調(diào)控IRF4表達(dá)來發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用