Gli2通過(guò)FoxM1調(diào)控KIF20A影響肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的：
　　肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一且預(yù)后不良。腫瘤的快速增殖、耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是阻礙肝癌治愈的主要原因，但內(nèi)在的腫瘤發(fā)生機(jī)制并未得到全面解釋?zhuān)谎芯孔C實(shí)肝癌的發(fā)生發(fā)展是由一系列基因的累積性改變所導(dǎo)致的。因此，針對(duì)腫瘤相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的異常改變進(jìn)行深入研究，將有助于發(fā)掘重要的分子靶點(diǎn)，進(jìn)而開(kāi)展針對(duì)腫瘤特異性生物分子（基因和/或蛋白）的高效靶向治療。

2、Hedgehog（Hh）信號(hào)通路的異常激活在腫瘤惡性增殖中起重要作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)Hh通路的主要組分（Shh、Ptch1、SMO、Gli1及Gli2）在肝癌細(xì)胞中異?；罨?，而抑制其效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gli2的表達(dá)能顯著削弱體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的增殖能力。但是 Gli2影響肝癌增殖的具體分子機(jī)制還待進(jìn)一步明晰。腫瘤細(xì)胞的增殖與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，有絲分裂相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白(Kinesins)在腫瘤細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中具有重要作用。Hh-Gli2通路對(duì)腫瘤增

3、殖的促進(jìn)作用是否通過(guò)調(diào)控并依賴有絲分裂相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)是本項(xiàng)研究的論證重點(diǎn)，研究從生物信息學(xué)、分子、細(xì)胞生物學(xué)以及臨床隊(duì)列等多層次進(jìn)行探索和驗(yàn)證，試圖闡明有絲分裂相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白 KIF20A受Hh-Gli2調(diào)控的分子機(jī)制，并證明Gli2-KIF20A信號(hào)軸在調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性增殖過(guò)程中的重要作用及靶點(diǎn)價(jià)值。本研究的開(kāi)展有助于明晰肝癌細(xì)胞惡性增殖的分子機(jī)制，為未來(lái)應(yīng)用于肝細(xì)胞癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：

4、　　第一部分：KIF20A是Hedgehog信號(hào)通路的下游靶基因
　　1、Hh信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖過(guò)程中起重要作用，為研究抑制Hh信號(hào)通路后肝細(xì)胞癌基因表達(dá)譜的變化，首先利用real-time PCR和Westernblot篩選出Gli2高表達(dá)的肝癌細(xì)胞系，并分別使用cyclopamine(SMO抑制劑)及GANT61(Gli1/2抑制劑)分別抑制Hh通路的上下游信號(hào)。通過(guò)Microarray技術(shù)尋找受Hh通路抑制影響

5、的靶基因簇
　　2、在NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索已公開(kāi)的肝癌表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集，進(jìn)行差異表達(dá)基因的大范圍meta分析，通過(guò)兩種meta分析的方法確定在肝癌組織中顯著高表達(dá)的基因。再將meta結(jié)果與受Cyclpamine及GANT61抑制的基因列表進(jìn)行交集以確定在肝癌中異常高表達(dá)且受 Hh通路調(diào)控的基因，并通過(guò) real-time PCR技術(shù)驗(yàn)證。
　　3、為進(jìn)一步研究是否 KIF20A受 Shh-Gli2通路的調(diào)控。在 Gl

6、i2高表達(dá)的HCC-LM3及 MHCC-97H細(xì)胞中干擾 Gli2的表達(dá)或利用 Hh通路抑制劑（Cyclpamine及GANT61）處理，之后利用Western bolt檢測(cè)KIF20A的蛋白表達(dá)情況。在另外兩株Gli2相對(duì)低表達(dá)的HepG2及Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Gli2表達(dá)質(zhì)?；蚴褂肗-shh處理后利用Western bolt檢測(cè)KIF20A的表達(dá)。為明確N-Shh是否通過(guò)Gli2調(diào)控KIF20A的表達(dá)，在N-shh存在的培養(yǎng)條件下抑制

7、HepG2中Gli2的表達(dá)，之后利用Western bolt檢測(cè)KIF20A蛋白水平變化。
　　第二部分：轉(zhuǎn)錄因子Gli2通過(guò)活化FoxM1調(diào)控KIF20A的表達(dá)
　　1、為進(jìn)一步研究Gli2是否通過(guò)激活KIF20A的啟動(dòng)子區(qū)來(lái)調(diào)控KIF20A的表達(dá)。我們構(gòu)建了偶聯(lián)熒光素報(bào)告基因的KIF20A啟動(dòng)子區(qū)。利用Dual-luciferase檢測(cè)增加或抑制Gli2表達(dá)后，KIF20A啟動(dòng)子區(qū)偶聯(lián)熒光素信號(hào)的變化。
　　2、為

8、確定Gli2是否通過(guò)與KIF20A啟動(dòng)子區(qū)直接相互作用調(diào)控KIF20A的表達(dá)，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè) Gli2在KIF20A啟動(dòng)子區(qū)的潛在結(jié)合位點(diǎn)，并利用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）檢測(cè)這些結(jié)合位點(diǎn)的有效性。
　　3、對(duì) ChIP驗(yàn)證的含有潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)（ FoxM1或KIF20A）進(jìn)行分段克隆，利用Dual-luciferase分析以確定ChIP所驗(yàn)證的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)是否具有功能。
　　第三部分：Gli2-

9、KIF20A信號(hào)軸調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程
　　1、為研究KIF20A在肝癌細(xì)胞中所起的生物學(xué)作用，利用miRNAi-KIF20A干擾質(zhì)粒抑制HepG2及HCC-LM3細(xì)胞中KIF20A的表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞增殖相關(guān)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)KIF20A對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　2、為研究抑制KIF20A表達(dá)影響肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，采用流式細(xì)胞分析檢測(cè)KIF20A表達(dá)抑制后細(xì)胞周期分布的變化。為確定KIF20A干擾后對(duì)HepG2細(xì)胞胞質(zhì)

10、分裂的影響，利用共聚焦實(shí)時(shí)活細(xì)胞拍攝技術(shù)及熒光顯微技術(shù)做進(jìn)一步分析。
　　3、為驗(yàn)證Gli2促進(jìn)肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程是否需要依賴下游KIF20A的表達(dá)，在Gli2過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，利用miRNAi干擾KIF20A的表達(dá)并通過(guò)克隆形成、流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)分析肝癌細(xì)胞增殖能力的變化。
　　4、為進(jìn)一步明確Gli2-KIF20A信號(hào)軸在肝癌細(xì)胞增殖中的重要性，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了三株分別穩(wěn)定表達(dá)（shRNA-control，shRN

11、A-Gli2， shRNA-KIF20A）的HCC-LM3細(xì)胞，并建立腫瘤裸鼠皮下移植瘤模型。觀察移植瘤在體內(nèi)的增殖情況。
　　第四部分：Gli2、FoxM1及KIF20A在肝癌組織中異常活化并顯著影響臨床預(yù)后
　　1、為驗(yàn)證體外及體內(nèi)研究的結(jié)果，我們通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)了Gli2, FoxM1及KIF20A在臨床肝癌樣本及其對(duì)應(yīng)非癌組織中的表達(dá)情況。使用“德國(guó)半定量”評(píng)分法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行評(píng)分。同時(shí)，通過(guò)Western blo

12、t在隨機(jī)選取的冰凍樣本中驗(yàn)證免疫組化分析結(jié)果。
　　2、利用Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)分析了Gli2、FoxM1和KIF20A三種基因在肝癌中表達(dá)的相關(guān)性。并采用卡方檢驗(yàn)或fisher確切概率卡方檢驗(yàn)分析Gli2, FoxM1, KIF20A與臨床病理特征間的相關(guān)性。
　　3、為研究Gli2、FoxM1、KIF20A的表達(dá)對(duì)肝癌患者生存預(yù)后的影響，利用Kaplan-Meier生存曲線分別分析了三個(gè)基因的高低表達(dá)對(duì)患者總生

13、存（OS）及無(wú)病生存（DFS）期的影響，并與其他因素同時(shí)納入多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型確定能顯著影響患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果：
　　第一部分：KIF20A是Hedgehog信號(hào)通路的下游靶基因
　　1、轉(zhuǎn)錄因子Gli2在HCC-LM3及MHCC-97H細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)，在HepG2中相對(duì)低表達(dá)，在 Bel-7402, Huh7及 SK-Hep1細(xì)胞呈中等表達(dá)水平。利用cyclopamine及GANT61抑制

14、Hh信號(hào)通路后，寡核苷酸表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)有335個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)共同下調(diào)(DiffScore<-50)。
　　2、依據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)共納入6項(xiàng)公開(kāi)發(fā)表的肝癌表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行 meta分析，meta分析確定175個(gè)基因在肝癌組織中顯著高表達(dá)。將Microarray分析發(fā)現(xiàn)的335受cyclopamine及GANT61抑制的基因與meta分析的175個(gè)基因進(jìn)行交集，發(fā)現(xiàn)7個(gè)Hh潛在靶基因在肝癌細(xì)胞中異?；罨?，其中KIF20A屬于驅(qū)動(dòng)蛋

15、白家族，其與細(xì)胞的有絲分裂及增殖密切相關(guān)。
　　3、經(jīng) cyclopamine, GANT61處理或轉(zhuǎn)染 Gli2-shRNA后，HCC-LM3及MHCC-97H細(xì)胞的KIF20A蛋白表達(dá)量顯著下降。HepG2及Huh7細(xì)胞經(jīng)N-shh刺激或轉(zhuǎn)染Gli2-myc后KIF20A蛋白表達(dá)水平顯著增高。然而，當(dāng)在HepG2中抑制Gli2的表達(dá)后阻斷了N-shh對(duì)KIF20A的刺激作用，證明N-shh需要通過(guò)Gli2調(diào)控KIF20A的表達(dá)

16、。
　　第二部分：轉(zhuǎn)錄因子Gli2通過(guò)活化FoxM1調(diào)控KIF20A的表達(dá)
　　1、在 HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)外源性的 Gli2后顯著增強(qiáng)了 KIF20A及 Bcl2的啟動(dòng)子區(qū)偶聯(lián)熒光素酶表達(dá)。而在HCC-LM3細(xì)胞中抑制Gli2的表達(dá)后顯著抑制了KIF20A及Bcl2的啟動(dòng)子區(qū)偶聯(lián)熒光素酶表達(dá)。
　　2、通過(guò)生物信息學(xué)在線分析軟件 MatInspector professional version7.2(http:/

17、/www.genomatix.de/)未發(fā)現(xiàn)KIF20A啟動(dòng)子區(qū)存在Gli2潛在結(jié)合位點(diǎn)。但是，在KIF20A的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1的潛在結(jié)合位點(diǎn)（2個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)及1個(gè)周期蛋白相關(guān)保守區(qū)域CHR），而在FoxM1的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)潛在的Gli2結(jié)合位點(diǎn)。 ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Gli2可以結(jié)合在FoxM1的啟動(dòng)子區(qū)（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-2165’-TCGCCACCCACG-3’-204）。FoxM1可通過(guò)周期蛋白相關(guān)保守區(qū)域C

18、HR（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游+3345’-TTTAAA-3’+349）結(jié)合KIF20A的啟動(dòng)子。
　　3、將 FoxM1及 KIF20A的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分段克隆入熒光素酶報(bào)告載體, Dual-luciferase分析證實(shí)ChIP驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)均具有功能。
　　第三部分：Gli2-KIF20A信號(hào)軸調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程
　　1、利用Western blot篩選出兩個(gè)在HepG2及HCC-LM3細(xì)胞中均能有效干擾

19、KIF20A表達(dá)的質(zhì)粒。干擾KIF20A表達(dá)后HepG2及HCC-LM3細(xì)胞的增殖速率及平板細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱。
　　2、細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)在HepG2及HCC-LM3細(xì)胞中干擾KIF20A表達(dá)后，導(dǎo)致細(xì)胞周期分布表現(xiàn)為G2/M及多核細(xì)胞比例的增加。免疫熒光及共聚焦實(shí)時(shí)活細(xì)胞拍攝技術(shù)發(fā)現(xiàn)干擾KIF20A表達(dá)后，肝癌細(xì)胞在有絲分裂后期分裂環(huán)內(nèi)陷出現(xiàn)障礙，最終導(dǎo)致胞質(zhì)分裂失敗。
　　3、在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Gli2可增強(qiáng)

20、細(xì)胞增殖及克隆形成的能力，增加CyclinD1 CyclinE2, CyclinB1的表達(dá)，但干擾KIF20A后由Gli2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng)便被阻斷了。
　　4、干擾Gli2及KIF20A后均能顯著抑制裸鼠移植瘤的增殖能力。相應(yīng)的， Western blot及IHC實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制Gli2的表達(dá)后FoxM1, KIF20A,細(xì)胞周期調(diào)控蛋白（如CyclinD1, CyclinE2及CyclinB1）及細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)均受到

21、顯著抑制。
　　第四部分：Gli2、FoxM1及KIF20A在肝癌組織中異常活化并顯著影響臨床預(yù)后
　　1、免疫組化法檢測(cè)Gli2, FoxM1和KIF20A在肝癌組織中的陽(yáng)性率分別達(dá)到43.9％、56.1%及51.4%，并且三者在肝癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁非腫瘤組織。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三者的表達(dá)趨勢(shì)與免疫組化實(shí)驗(yàn)一致。
　　2、Gli2, FoxM1及KIF20A在肝癌中兩兩表達(dá)呈正相關(guān)。高表達(dá)的G

22、li2與CA-199水平、腫瘤直徑、病理分級(jí)、脈管侵犯及HBV感染相關(guān)；高表達(dá)的FoxM1與病理分級(jí)有關(guān)；高表達(dá)的 KIF20A與腫瘤直徑、病理分級(jí)、脈管侵犯、HBV感染及TNM分期有關(guān)。
　　3、單因素分析顯示腫瘤直徑、病理分級(jí)、脈管侵犯、TNM分期、Gli2、FoxM1及KIF20A表達(dá)顯著影響OS及DFS。納入多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型后腫瘤直徑、病理分級(jí)、Gli2、 FoxM1及KIF20A表達(dá)是肝癌無(wú)病生存期的獨(dú)立預(yù)后

23、因素，而腫瘤直徑、病理分級(jí)、脈管侵犯、Gli2及KIF20A表達(dá)是肝癌總生存的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　結(jié)論：
　　1、抑制Hh信號(hào)通路可顯著抑制驅(qū)動(dòng)蛋白基因KIF20A的表達(dá)，且KIF20A的mRNA水平在肝癌組織中異常升高。轉(zhuǎn)錄因子Gli2介導(dǎo)了Hh通路對(duì)KIF20A表達(dá)的調(diào)控。
　　2、在肝癌細(xì)胞中 Gli2轉(zhuǎn)錄調(diào)控 KIF20A的表達(dá)，且 Gli2能直接轉(zhuǎn)錄激活FoxM1，活化的FoxM1再結(jié)合在KIF20A啟動(dòng)子C