Fox01對糖尿病大鼠足細胞影響的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)微血管并發(fā)癥之一，常導致終末期腎病。DN足細胞損傷常表現(xiàn)為足突融合消失、細胞體積逐漸變小、陰離子電荷減少，最終足細胞可從腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)上脫落到腎小囊里并從尿液中排出[1]。目前，隨著足細胞系的建立，足細胞損傷在DN發(fā)病中被認為是引起DN蛋白尿和腎小球硬化的關鍵[2]。
　　叉頭狀轉錄因子O1（Forkhead

2、 transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）是FoxO家族中的一員，當被磷酸化后可導致其轉錄活性降低，引起FoxO1靶基因的表達下降[3]。本課題組前期實驗[4]發(fā)現(xiàn)DN大鼠腎皮質FoxO1表達及活性下降，隨后[5]又發(fā)現(xiàn)DN治療組大鼠腎臟的FoxO1較未治療組磷酸化水平顯著降低，活性顯著增強，電鏡下足突融合減輕，提示FoxO1的活性變化可能和DN中足細胞損傷情況有關，但并沒有驗證兩者的直接關系，目前國內外也沒有相關報

3、道。另有文獻[6]報道，PI3K/Akt信號通路可能參與了DN足細胞損傷的發(fā)生與發(fā)展。Foxo1作為PI3K/Akt信號通路的下游因子，我們認為其活性的改變很可能也參與了DN足細胞的損傷過程。
　　本研究旨在通過上調FoxO1的表達，觀察FoxO1對糖尿病大鼠足細胞的影響。
　　材料與方法：
　　健康、雄性清潔級SD大鼠120只，體重(100±20)g，IVC系統(tǒng)中喂養(yǎng)。待大鼠達到8周齡，體重(220±20)g，隨機選

4、取90只建立DM大鼠模型，并隨機分為DM+空慢病毒(LV-pSC-GFP)感染組（a組，n=30），DM+大鼠結構性活性FoxO1慢病毒(LV-CA-FoxO1)感染組（b組，n=30），DM組（d組，n=30）。剩余大鼠注射相等體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液作為正常對照組(c組，n=30)。DM大鼠造模方法如下:將其禁食12h后，按60mg/kg一次性腹腔注射1％STZ溶液，72h后連續(xù)三次測定血糖(BG)≥16.7mmol/L，為DM

5、成模標準。各組大鼠自由進食飲水，不給予任何降糖藥物治療。待DM大鼠造模成功、血糖穩(wěn)定5天后，采用腎臟多部位靶向注射重組慢病毒的方法[7]分別將100ulLV-pSC-GFP、LV-CA-FoxO1（慢病毒滴度檢測為7×108TU/ml，綜合考慮慢病毒感染效率及細胞毒性后明確感染大鼠的最佳感染量為100ul）注射到a、b組大鼠的右腎皮質多個部位。c組和d組注射等量的生理鹽水。于感染后的2、4、8w末，將各組大鼠置于代謝籠收集24小時尿，離

6、心后保存于4℃冰箱，用來測定24小時尿蛋白(UPro/24h)、尿白蛋白定量(UAlb)以及尿沉渣中足盂蛋白(podocalyxin，PCX)的含量。麻醉后內眥靜脈取血，分離血清檢測血肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）。處死大鼠取出右腎去包膜測腎重并進行以下取材。a、b兩組大鼠取右腎背側下1/2做冰凍切片以及光鏡切片，觀察慢病毒感染情況，c、d組直接將切下的背側下1/2組織置于4％多聚甲醛中固定用于制作光鏡切片觀察腎小球病理學變化。a、b

7、、e、d四組取米粒(約1mm3)大小腎組織（包括注射點在內）迅速放入冷戊二醛固定液中用于電鏡觀察腎臟超微結構變化，剩余腎組織迅速置于-80℃冰箱里，用于Real-timePCR和Western blotting檢測FoxO1、足盂蛋白(podocalyxin，PCX)、nephrin、Ⅳ型膠原α3鏈(COL4A3)、Ⅳ型膠原α5鏈(COL4A5)、結蛋白(desmin)的表達。
　　結果：
　　1.熒光顯微鏡下，可觀察到a組

8、和b組大鼠腎臟冰凍切片中都有綠色熒光蛋白(GFP)的有效表達，提示慢病毒感染成功。
　　2.2周末，四組大鼠的UPro/24h、UAlb、Scr、BUN差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與c組比較，a、d組BG升高，KI升高（均P＜0.05），BW降低(P＜0.05)，b組與a、d組比，BG、BW無明顯差別(P＞0.05)，KI降低(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05)。在4、8周末，與c組相比，a、d組BG、KI、UPr

9、o/24h、UAlb、Scr、BUN水平顯著升高，BW水平明顯降低（均P＜0.05）;與a、d組比較，b組KI、UPro/24h、UAlb、Scr和BUN水平明顯降低（均P＜0.05），但仍高于c組(P＜0.05)，b組BG水平較a、d組略有下降、BW水平略有上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。a組和d組各觀察點各項指標均無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.ELISA結果:2、4、8周末，與c組相比，a組和d組大鼠尿沉渣中

10、PCX含量顯著增高(P＜0.05);與a、d組比較，b組尿沉渣PCX含量明顯下降(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05);a與d組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。除c組外，各組該指標呈時間依賴性變化。
　　4.在2、4、8周末各個觀察點上，a和d組大鼠腎皮質中的FoxO1、nephrin、PCXmRNA表達水平顯著低于c組(P＜0.05);b組大鼠三者mRNA表達水平顯著高于a、d組(P＜0.05)，但nephrin、PC

11、X的mRNA水平仍低于c組(P＜0.05)，同時FoxO1顯著高于c組(P＜0.05)。a組和d組腎皮質中COL4A3、COL4A5以及desminmRNA表達水平顯著高于c組(P＜0.05);b組這三項指標較a和d組顯著下降(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05)。a組和d組各項指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　5.Westernblot結果顯示，在第2、4、8周末各個觀察點上，a組和d組較c組大鼠腎皮質中的Fo

12、xO1蛋白表達水平無顯著差異(P＞0.05)，但FoxO1/p-FoxO1、nephrin、PCX蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)，b組大鼠腎臟FoxO1、nephrin、PCX蛋白表達水平顯著高于a、d兩組(P＜0.05)，但nephrin、PCX仍低于c組(P＜0.05)，同時b組的FoxO1蛋白表達水平與FoxO1/p-FoxO1顯著高于c組(P＜0.05)。a、d兩組的COL4A3、COL4A5以及desmin的蛋白表達水平

13、顯著高于c組(P＜0.05);b組的COL4A3、COL4A5以及desmin蛋白這三項指標較a和d組顯著下降(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05)。a組和d組各項指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6.腎臟病理變化:光鏡下c組大鼠腎小球結構未見明顯異常，a、d組差異不大，可見腎小球體積增大，系膜細胞增生，細胞外基質增多，基底膜增厚，以8周末變化最明顯;電鏡下c組大鼠腎小球結構未見明顯異常，未見基底膜及內皮細胞增厚