EV71調控N9信號通路的機理研究.pdf

1、背景和目的：
　　手足口病是由腸道病毒引起的，以手、足、口出現(xiàn)水皰為特征，多見于5歲以下兒童的傳染病，EV71是引起重癥手足口病的主要病毒之一。它是繼脊髓灰質炎病毒后又一嗜神經病毒，主要攻擊神經元，其感染導致的重癥患者常伴隨神經系統(tǒng)的癥狀，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓炎、小腦共濟失調等。
　　病毒作為嚴格的細胞內寄生生物，在感染的過程中，受刺激的細胞會通過調動自身的免疫防御系統(tǒng)來抵御病毒的入侵并實現(xiàn)對病毒的清除。因此，為了

2、進行成功的入侵，病毒必須俘獲細胞內關鍵的信號通路，以脅迫宿主細胞為其入侵與增殖服務。這些信號通路中研究比較多的就是MAPKs信號通路和PI3K/Akt通路。信號通路的功能十分廣泛，能調節(jié)細胞的增殖，分化，凋亡等。
　　EV71感染不僅會伴隨有神經系統(tǒng)的癥狀，同時也會引起嚴重的炎癥反應。EV71感染的患者腦中有大量IL-6的分泌，且這升高的IL-6能代表IL-1和TNF-a的凈效應。
　　關于EV71病毒感染調節(jié)信號通路的研究

3、頗多，EV71感染引起重癥患者多伴隨中樞神經系統(tǒng)的癥狀，而小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)的免疫細胞，在被EV71感染后對信號通路和細胞因子產生的影響尚未報道，本研究檢測了EV71感染后對信號通路和細胞因子的調節(jié)，同時根據(jù)病毒的結構特點，構建了11個重組質粒，以探究病毒感染調控的信號通路是否由單個病毒蛋白所介導。
　　方法：
　　1. EV71病毒擴增，TCID50方法檢測滴度后感染小膠質細胞
　　2.研究病毒感染后對信號通

4、路的影響：分不同的時間點（30 min,2 h,4 h,6 h,8 h,12 h,24 h）收取病毒感染后SDS裂解液裂解的細胞蛋白，用western blot檢測病毒感染后對信號通路的調節(jié)
　　3.檢測細胞因子IL-6和病毒的復制情況：分兩個時間點（12 h和24 h）收取先經相應信號通路的抑制劑處理再病毒感染的培養(yǎng)上清，一部分根據(jù)EV71的通用引物用real-time PCR檢測病毒的滴度，另一部分用ELISA檢測IL-6的產

5、生。
　　4.明確EV71的結構特點，將其11個片段分別克隆出來，并構建出11個重組質粒。
　　5.探討單個病毒蛋白與被調控信號通路的關系：分別將這11個重組載體轉染至細胞中，以探究病毒感染調控的信號通路是否由單個病毒蛋白所介導。
　　結果：
　　1. EV71感染小膠質細胞N9激活ERK1/2和p38信號通路，細胞因子IL-6的產生增加；在小膠質細胞BV2中則是抑制PI3K/Akt通路。
　　2.確認ER

6、K1/2的抑制劑U0126和p38的抑制劑SB203580能抑制ERK1/2和p38信號通路的激活。
　　3.在EV71感染的N9細胞系中，細胞因子IL-6的產生增加，當分別使用ERK1/2和p38的抑制劑U0126和SB203580抑制ERK1/2和p38信號通路的激活時，升高的IL-6分泌量均下降，且p38的下降量更明顯。同時檢測到抑制p38信號通路使病毒的復制也受到抑制。
　　4.表達單個病毒蛋白的細胞未檢測到類似病毒

7、感染所調控的信號通路的變化。
　　結論：
　　在小膠質細胞系N9，EV71病毒感染激活ERK1/2和p38信號通路，提高細胞因子IL-6的產生，當ERK1/2和p38的激活分別被抑制劑U0126（ERK1/2）和SB203580（p38）阻斷時，結果顯示ERK1/2和p38信號通路在細胞因子IL-6的產生和病毒復制中發(fā)揮著重要作用，阻斷通路的激活減少了IL-6的分泌和病毒的復制。且較ERK1/2通路而言，p38通路在炎癥因子