EV71與干擾素相互作用的機理研究.pdf

1、EV71(Enterovirus 71)引發(fā)的手足口病在近年來的發(fā)病率仍然很高。截止目前,對于EV71感染,尚沒有有效的疫苗和治療辦法。干擾素作為廣譜抗病毒藥物,已成功用于多種病毒感染疾病的治療,研究顯示干擾素可抑制EV71的復(fù)制,但EV71病毒也可在一定程度上逃避干擾素的抑制作用。本實驗旨在探索EV71拮抗干擾素抗病毒作用的機制。
　　本實驗獲取五株EV71病毒:安徽株(Anhui2007)一株,VR1432和VR1775(購自

2、ATCC,American Type Culture Collection,美國模式菌種保藏庫),GDV103和GDV102(購自CCTCC,China Center for Type Culture Collection,中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。根據(jù)GenBank中EV71的全基因組序列設(shè)計了6對引物,分段擴增了覆蓋EV71(安徽株,VR1432,GDV103)基因組全長序列的6個重疊片段,并進行序列測定和分析。三株EV71全基因組

3、核苷酸序列已被GenBank數(shù)據(jù)庫收錄,Anhui2007(安徽株)、VR1432和GDV103的登陸編號分別為KC954662、KC954664和KC954663。進化樹分析顯示安徽株EV71和GDV103屬于C基因型中的C4基因亞型,VR1432屬于C基因型中的C2基因亞型。通過結(jié)晶紫染色的方法在VeroE6和MRC-5細(xì)胞上初步測定了IFN-ω和IFN-α對安徽株,VR1432,GDV103和GDV102四株病毒的保護效果。結(jié)果顯

4、示IFN-ω的整體保護效果要好于IFN-α,其中,IFN-ω保護VR1432、Anhui、GDV103和GDV102四株病毒感染細(xì)胞的EC50分別為1810.7IU/ml、931.5IU/ml、385.8IU/ml、40.6IU/ml;IFN-α2b保護GDV102感染細(xì)胞的EC50為846.9IU/ml,當(dāng)IFN-α2b的濃度達到50000IU/ml時,對VR1432、Anhui、GDV103三株病毒感染的細(xì)胞仍沒有達到100％的保護

5、效果,同時發(fā)現(xiàn)病毒在VeroE6中比在MRC-5中對干擾素的保護作用更敏感。隨后用定量PCR法(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)對經(jīng)IFN-ω和IFN-α預(yù)處理的VeroE6細(xì)胞的兩株EV71,GDV103和VR1432的拷貝數(shù)變化進行了測定。結(jié)果顯示病毒拷貝數(shù)隨干擾素濃度的升高呈現(xiàn)明顯的下降趨勢,且IFN-ω抑制病毒復(fù)制的能力要顯著強于IFN-α2b。
　　為了探索EV71與干擾素相互作用的

6、機制,本實驗研究了GDV103,VR1432感染MRC-5和RD細(xì)胞對干擾素信號通路的影響。本研究首先在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測了兩株病毒是否能刺激MRC-5產(chǎn)生IFN-β,VSV作為陽性對照,反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse PCR,RT-PCR)和WB結(jié)果顯示兩株EV71均不能刺激MRC-5產(chǎn)生IFN-β。隨后PCRArray檢測了EV71感染對I型干擾素信號通路中各基因表達的影響。GDV103以MOI為10感染MRC-5細(xì)胞,未感染的為對照

7、,隨后用1000IU/ml的IFN-α2b刺激細(xì)胞1h。將四組細(xì)胞提取RNA后進行PCRArray分析,結(jié)果顯示GDV103感染后顯著抑制了IFN-α誘導(dǎo)的抗病毒基因的表達。即EV71通過抑制內(nèi)源干擾素產(chǎn)生和拮抗外源干擾素作用從而利于其存活和復(fù)制。
　　I型干擾素通過經(jīng)典的JAK-STAT信號通路激活下游的抗病毒蛋白基因從而發(fā)揮抗病毒作用。EV71可以通過干擾此信號通路的任一環(huán)節(jié)來最終抑制抗病毒蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于STAT1

8、和STAT2的磷酸化是JAK-STAT信號通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),本研究首先檢測了EV71感染對STAT1和STAT2磷酸化的影響。GDV103和VR1432以低MOI(MOI=1)感染MRC-5和Vero E6細(xì)胞時,Western Blot顯示p-STAT1,p-STAT2的量沒有明顯變化。將EV71感染的MOI提高為10后感染MRC-5和RD,WB結(jié)果顯示IFNα-2b刺激細(xì)胞后,p-STAT1和p-STAT2的表達有明顯增加,且隨著E

9、V71感染時間的延長,磷酸化的STAT1和磷酸化的STAT2的蛋白含量有明顯下降,而STAT1和STAT2蛋白含量保持不變,即EV71感染MRC-5和RD細(xì)胞均抑制了STAT1和STAT2的磷酸化。此后,本研究繼續(xù)檢測了EV71感染對ISGF3核轉(zhuǎn)位的影響,將pEGFP-C1-STAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞,VR1432感染后加入干擾素,核質(zhì)分離結(jié)果顯示EV71感染抑制了ISGF3的核轉(zhuǎn)位。既然STAT1、STAT2的磷酸化及隨后

10、的ISGF3的核轉(zhuǎn)位均受到了抑制,本研究繼續(xù)檢測了其上游細(xì)胞膜上受體IFNAR1的表達,WesternBlot和流式細(xì)胞分析結(jié)果均顯示無論干擾素刺激與否,EV71感染均未影響IFNAR1受體的表達。本研究隨之檢測了與受體偶聯(lián)的JAK(Janus activated kinse)激酶家族的Jak1和Tyk2的表達,Western Blot結(jié)果顯示在MRC-5和RD細(xì)胞中,EV71感染下調(diào)了Jak1的表達,未影響Tyk2的表達,但抑制了IF

11、Nα-2b誘導(dǎo)的Jak1和Tyk2的磷酸化。
　　隨后本研究繼續(xù)探討了EV71下調(diào)Jak1的機制,qRT-PCR檢測顯示隨著EV71感染時間的延長,Jak1的mRNA水平?jīng)]有下降,即Jak1蛋白的下降未發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。由于蛋白酶體通路是病毒介導(dǎo)的降解信號通路中信號分子的一種普遍途徑,本研究用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后,Western Blot顯示EV71感染引起Jak1的下調(diào)并未得到恢復(fù),即Jak1的減少不依賴于蛋白酶體通

12、路。接下來考察了EV71誘導(dǎo)的自噬溶酶體途徑對Jak1蛋白的影響,用自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞后檢測EV71感染對Jak1表達的影響,結(jié)果顯示3-MA加入后EV71感染引起的Jak1的下降未得到補償,即Jak1的減少可能不是細(xì)胞自噬引起的。隨后用溶酶體抑制劑E64處理細(xì)胞,Western Blot檢測Jak1在EV71感染后的表達有恢復(fù),即EV71感染引起的Jak1的下降可能依賴于溶酶體通路。
　　本實驗進一步探討了EV71下調(diào)磷

13、酸化STAT1和STAT2的機制。檢測了細(xì)胞信號因子抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling,SOCS),STAT激活的抑制蛋白(protein inhibitor of activated STATs,PIAS),酪氨酸磷酸酶蛋白(protein tyrosine phosphatases,PTP),結(jié)果顯示這三種蛋白均不影響STAT1蛋白的磷酸化水平。在EV71的7個非結(jié)構(gòu)蛋白中(2A、2B、2C、

14、3A、3B、3C和3D),2A和3C是具有蛋白酶功能的蛋白,有文獻報道EV71的2A通過減少IFNAR1的表達抑制I型干擾素信號通路,但本研究結(jié)果顯示2A和3C均沒有降低Jak1的表達以及抑制STAT1和STAT2的磷酸化。
　　綜上所述,本課題研究結(jié)果顯示EV71感染宿主細(xì)胞后,通過下調(diào)Jak1蛋白水平,降低了Jak1和Tyk2的磷酸化水平,進而抑制STAT1和STAT2的磷酸化,并最終抑制I型干擾素信號通路。EV71感染引起的