ROS介導(dǎo)羅哌卡因致SH-SY5Y細胞損傷及其8-oxoG突變修復(fù)作用的研究.pdf

1、局部麻醉藥（局麻藥）為臨床局部麻醉和疼痛治療中的常用藥物，但該類藥物具有潛在的神經(jīng)毒性。隨著神經(jīng)阻滯麻醉的廣泛應(yīng)用，局麻藥引起神經(jīng)毒性反應(yīng)的報道逐漸增多，已引起臨床工作者高度重視。許多研究發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)毒性與局麻藥引起的神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)，但其確切機制仍未完全闡明。
　　 DNA損傷劑、過氧化物、蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié)因子、鈣離子自穩(wěn)狀態(tài)、一氧化氮、神經(jīng)營養(yǎng)因子等許多因素均可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細胞凋亡細胞產(chǎn)生特征性形態(tài)改變

2、，在DNA降解之前，線粒體膜功能發(fā)生紊亂，內(nèi)膜跨膜電位消失，線粒體內(nèi)蛋白酶活化物釋放，激發(fā)各種凋亡相關(guān)的代謝變化。細胞內(nèi)活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)的爆發(fā)是導(dǎo)致神經(jīng)細胞急性損傷的主要因素之一。ROS在神經(jīng)細胞內(nèi)蓄積時，可破壞細胞內(nèi)氧化還原動態(tài)平衡，損傷線粒體膜;此外，ROS可直接與蛋白、脂質(zhì)、核酸等發(fā)揮作用使其失去功能，亦可起中間信使作用，進一步引發(fā)神經(jīng)損傷。研究表明，布比卡因可使Schwann細胞內(nèi)R

3、OS爆發(fā)，觸發(fā)細胞凋亡。但局麻藥羅哌卡因誘發(fā)的神經(jīng)毒性是否與ROS產(chǎn)生和介導(dǎo)有關(guān)，目前尚不清楚。
　　 本科研小組前期研究發(fā)現(xiàn)，布比卡因可能通過干擾神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y氧化磷酸化和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，使ATP生成減少，導(dǎo)致單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)持續(xù)激活，并引起細胞內(nèi)部分線粒體的ROS產(chǎn)生和釋放增多，通過ROS誘導(dǎo)ROS釋放機制使ROS爆發(fā)，從而導(dǎo)

4、致細胞損傷和凋亡;進一步發(fā)現(xiàn)布比卡可通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase，p38MAPK)途徑和線粒體Cl-通道誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡。
　　 羅哌卡因和布比卡因同屬酰胺類局麻藥，理化性質(zhì)相似，但兩者的作用并不完全相同，但羅哌卡因脂溶性小于布比卡因，其心臟毒性作用顯著弱于布比卡因，且胎兒對該藥具有良好耐受性。因此，羅哌卡因在臨床中應(yīng)用逐漸增多，尤其適用于術(shù)后鎮(zhèn)痛和產(chǎn)科麻醉

5、。但羅哌卡因仍有潛在的神經(jīng)毒性，研究羅哌卡因引發(fā)的神經(jīng)毒性損傷機制，減少與避免神經(jīng)并發(fā)癥具有重要的臨床意義。以往研究認為羅哌卡因不影響纖維母細胞ROS的生成，但羅哌卡因?qū)H-SY5Y細胞的ROS是否有影響？目前國內(nèi)外尚未報道。如果羅哌卡因能誘發(fā)SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS增多，若與布比卡因比較，何者作用更強？其導(dǎo)致細胞凋亡的主要作用靶點又是什么？這些機制均有待深入研究。
　　 ROS是導(dǎo)致DNA損傷的重要因素，DNA損傷后修復(fù)的

6、機制錯綜復(fù)雜，DNA損傷與修復(fù)直接關(guān)聯(lián)到細胞結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)，因而受到日益重視。局麻藥在神經(jīng)細胞引起的氧化應(yīng)激后DNA的損傷及修復(fù)機制是如何？目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，8-氧鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)是由大量ROS直接攻擊細胞DNA中的鳥嘌呤(dG)，使脫氧鳥苷氧化而產(chǎn)生。8-oxoG是一種前致突變物，在DNA復(fù)制時，聚合酶經(jīng)常將胸腺嘧啶(T)與8-oxoG配對，這樣G-C配對就會轉(zhuǎn)變成為A-T配對，A/8-oxo

7、G的錯配會導(dǎo)致基因G∶C到T∶A的突變。DNA鏈8-oxoG突變修復(fù)有兩種類型，一種由8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoGuanineDNAGlycosylase，OGG1)負責(zé)直接切除8-oxoG;另一種先由MSH2/MYH修復(fù)酶切除與8-oxoG配對的A，然后再由OGG1切除8-oxoG從而完成修復(fù)過程。機體通過抗氧化防御系統(tǒng)以及DNA修復(fù)系統(tǒng)可以有效的抵御活性自由基誘發(fā)的DNA損傷，但如果損傷因素過強，超過了機體防御系統(tǒng)的保護

8、能力，DNA修復(fù)系統(tǒng)不足以完成全部突變的修復(fù)，則會累積起來引起機體一系列異常改變，可導(dǎo)致細胞的凋亡和疾病的發(fā)生。
　　 我們推測，局麻藥引發(fā)的神經(jīng)損傷可能與ROS產(chǎn)生導(dǎo)致8-oxoG突變有關(guān)，而負責(zé)修復(fù)該突變的DNA修復(fù)酶OGG1,MSH2和MYH可能在神經(jīng)細胞損傷后被激活，并發(fā)揮其重要的修復(fù)作用，抵御局麻藥致神經(jīng)細胞凋亡的作用。
　　 綜上所述，本研究擬從細胞水平，應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段，比較羅哌卡因和布比卡因

9、誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡及ROS爆發(fā)的作用;并建立AMPK高表達及低表達細胞株，進一步研究AMPK在羅哌卡因誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生中的作用。另外，我們使用氯離子阻斷劑4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'-disulfonicaciddisodium(DIDS)及p38MAPK拮抗劑吡啶咪唑化合物SB203580(4-(4-氟苯基)-2-（4-甲基亞磺酰基苯基）-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)4-(4-Fluo

10、ropheny1)-2-[4-(methylsulfiny1)pheny1]-5-(4-pyridy1)-1H-imidazole)預(yù)處理SH-SY5Y細胞，研究羅哌卡因?qū)H-SY5Y細胞線粒體和p38MAPK的影響，以探討羅哌卡因引發(fā)細胞凋亡是否與p38MAPK信號通路和線粒體氯離子通道被激活有關(guān)。本課題還將對羅哌卡因致神經(jīng)損傷后DNA修復(fù)系統(tǒng)（包括8-oxoG的產(chǎn)生和DNA修復(fù)酶hOGG1，hMYH和hMSH2酶）的作用做初步的研

11、究，探討該系統(tǒng)在羅哌卡因致神經(jīng)損傷后修復(fù)中的作用，為預(yù)防臨床中羅哌卡因引起的神經(jīng)毒性及開發(fā)有效的治療藥物提供重要的理論依據(jù)。
　　 第1章:羅哌卡因和布比卡因誘發(fā)SH-SY5Y細胞凋亡及ROS產(chǎn)生作用的比較
　　 目的:探討羅哌卡因和布比卡因誘發(fā)SH-SY5Y細胞產(chǎn)生的ROS水平與其致細胞凋亡的關(guān)系。
　　 方法:以SH-SY5Y細胞為研究對象，分別用含3mmol/L羅哌卡因和3mmol/L布比卡因的培養(yǎng)液處理1

12、、2、3、4、5、6h后，檢測細胞內(nèi)ROS水平;3mmol/L羅哌卡因和3mmol/L布比卡因處理SH-SY5Y細胞4h后，檢測細胞活力及細胞凋亡率。計量資料以(-χ)±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。不同藥物處理組在各時間點測得的ROS水平比較采用析因設(shè)計資料的方差分析。細胞活力及凋亡率均采用完全隨機單因素方差分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，細胞經(jīng)3m

13、mol/l羅哌卡因或3mmol/l布比卡因處理后，細胞內(nèi)ROS水平逐漸增高，均于第4h達高峰（羅哌卡因組ROS為146.07±4.68，布比卡因組ROS為268.06±12.73），ROS水平在第5、6h出現(xiàn)下降趨勢。同未處理組比較，藥物處理組細胞內(nèi)ROS水平在第1、2、3、4、5、6h均高于未處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。羅哌卡因處理組的ROS水平在各時間點均低于布比卡因處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同未處理組

14、比較，細胞經(jīng)3mmol/l羅哌卡因或3mmol/l布比卡因處理4h后，細胞活力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但羅哌卡因組細胞活力（60.91％±1.91％）明顯高于布比卡因處理組（35.91％±1.66％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。未處理組細胞凋亡率為4.44％±0.63％，羅哌卡因組和布比卡因組細胞凋亡率分別為36.34％±2.74％和64.19％±2.99％;經(jīng)藥物處理后，羅哌卡因組或布比卡因組的細胞凋亡率明

15、顯增加，與未處理組細胞凋亡率比較，藥物處理后細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但羅哌卡因組的細胞凋亡率明顯低于布比卡因組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:羅哌卡因與布比卡因均能通過誘發(fā)SH-SY5Y細胞ROS增多導(dǎo)致細胞凋亡，但羅哌卡因引發(fā)ROS產(chǎn)生的水平較布比卡因低，誘導(dǎo)細胞凋亡的作用較布比卡因弱。
　　 第2章:AMPK介導(dǎo)羅哌卡因致SH-SY5Y細胞ROS增多和凋亡的作用研究
　　

16、 目的:探討羅哌卡因能否通過激活A(yù)MPK致SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS增多并引發(fā)細胞凋亡。
　　 方法:將質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2和pEGFP-N1-AMPKα2轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞株，細胞分為pEGFP-N1-AMPKα2組（AMPKα2組），pEGFP-N1組（blank組），pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2組（siAMPKα2組），pGPU6/GFP/NeoNC組（NC組）

17、和未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的對照組（control組）。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的SH-SY5Y細胞經(jīng)3mmol/L羅哌卡因處理4h后，Westernblot法檢測AMPKα2和磷酸化AMPKα2(p-AMPKα2)蛋白表達。流式細胞術(shù)檢測各組細胞內(nèi)ROS水平。MTT檢測各組細胞活力、流式細胞術(shù)和Hoechst33258染色法檢測各組細胞凋亡率。同時，檢測未用羅哌卡因處理的各組細胞的上述相同指標(biāo)。
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-χ)±s)表示，采

18、用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后AMPKα2蛋白表達量采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法;羅哌卡因理后細胞活力、ROS水平、p-AMPKα2蛋白表達水平和細胞凋亡率采用兩因素析因設(shè)計資料方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett'sT3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，AMPKα2組的AMPKα2蛋白表達顯著高于control組(P＜0.01)，siAMPKα

19、2組的AMPKα2蛋白表達顯著低于control組（P＜0.01）。羅哌卡因處理后，AMPKα2組的p-AMPKα2蛋白表達顯著高于control組(P＜0.01)，siAMPKα2組的p-AMPKα2蛋白表達顯著低于control組（P＜0.01）。經(jīng)羅哌卡因處理后，細胞內(nèi)ROS含量顯著增多，AMPKα2組的ROS水平均高于其它組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;siAMPKα2組ROS水平低于blank組、NC組和control組

20、，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。MTT檢測結(jié)果顯示，羅哌卡因處理后AMPKα2組細胞活力為43.74％±2.27％，低于control組（54.43％±8.17％）(P＜0.01);siAMPKα2組細胞活力（67.22％±2.51％）高于control組(P＜0.01)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，羅哌卡因處理4h后AMPKα2組細胞凋亡率為46.65％±4.44％，高于control組（33.34％±2.80％）（P＜0.01）;s

21、iAMPKα2組細胞凋亡率為21.77％±2.83％，低于control組（P＜0.01）。Hoechst33258染色法檢測顯示，經(jīng)羅哌卡因處理后AMPKα2組出現(xiàn)更多濃染致密的顆粒狀熒光、染色質(zhì)固縮、亮藍色的凋亡細胞，其凋亡率為46.51％±4.94％，高于control組（33.84％±2.82％）（P＜0.01）;siAMPKα2組細胞凋亡率為22.70％±2.68％，低于control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

22、r>　　 結(jié)論:SH-SY5Y細胞內(nèi)AMPKα2過表達可促進羅哌卡因誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS大量增多并導(dǎo)致細胞凋亡，而下調(diào)AMPKα2表達可抑制羅哌卡因誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和細胞凋亡;羅哌卡因可通過激活A(yù)MPK致SH-SY5Y細胞ROS爆發(fā)性增多，從而引起細胞凋亡。
　　 第3章:線粒體Cl-通道和p38MAPK信號傳導(dǎo)通路在羅哌卡因致SH-SY5Y細胞凋亡中的作用研究
　　 目的:探討羅哌卡因致SH-SY5Y細胞ROS增多，

23、對細胞線粒體Cl-通道和p38MAPK的影響，以揭示線粒體Cl-通道和p38MAPK信號傳導(dǎo)通路在羅哌卡因致SH-SY5Y細胞凋亡中的作用
　　 方法:將SH-SY5Y細胞隨機分為4組:DIDS組、SB203580組、DIDS+SB203580組和無預(yù)處理組（Non-pretreated組）。DIDS組、SB203580組和DIDS+SB203580組細胞分別經(jīng)50μmol/lDIDS、10μmol/lSB203580、50μm

24、ol/lDIDS+10μmol/lSB203580預(yù)處理30min后用含3mmol/l羅哌卡因的培養(yǎng)液處理細胞，Non-pretreated組用含3mmol/l羅哌卡因的培養(yǎng)液處理細胞。各組細胞經(jīng)羅哌卡因處理4h后用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS水平，四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazole-carbocyanideiodine,JC-1

25、)檢測線粒體膜電位，Westemblot法檢測p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達水平，激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體內(nèi)Cl-熒光強度，MTT法檢測細胞活力，Hoechst33258染色法和流式細胞術(shù)細胞凋亡。同時，未用羅哌卡因處理的各組細胞在相同時間點檢測上述相同的指標(biāo)作為對照。
　　 結(jié)果:羅哌卡因處理后，DIDS組和DIDS+SB203580組細胞內(nèi)ROS水平低于Non-pretreated組(P＜0.01)。流式細胞術(shù)

26、檢測線粒體膜JC-1聚合體/單體熒光強度比值顯示，DIDS組和DIDS+SB203580組分別為0.81±0.02和0.83±0.03，均高于Non-pretreated組(0.52±0.02)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體內(nèi)Cl-濃度顯示，各組無顯著性差異（P＞0.05）。Westernblot顯示，DIDS組和DIDS+SB203580組的p-p38MAPK蛋白表達水平均低于Non-pretreat

27、ed組。MTT檢測顯示，DIDS組和SB203580組的細胞活力高于Non-pretreated組(P＜0.01)，但均低于DIDS+SB203580組(P＜0.01)。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率顯示，羅哌卡因處理后DIDS組、DIDS+SB203580組、SB203580組和Non-pretreated組分別為27.70％±3.71％、17.21％±4.20％、28.13％±3.59％和42.76％±4.77％;SB203580組細胞凋

28、亡率較Non-pretreated組低(P＜0.01)，但細胞內(nèi)ROS和JC-1聚合體/單體熒光強度比值與Non-pretreated組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Hoechst33258染色法檢測顯示，經(jīng)羅哌卡因處理后DIDS組、DIDS+SB203580組、SB203580組和Non-pretreated組的凋亡率分別為28.01％±3.08％、16.77％±4.41％、27.15％±2.54％和42.98％±5.69％

29、r>　　 結(jié)論:羅哌卡因引發(fā)SH-SY5Y細胞ROS增多后，使線粒體的通透性轉(zhuǎn)移孔開放，導(dǎo)致線粒體膜電位降低、通透性增大和p38MAPK激活，導(dǎo)致SH-SY5Y細胞凋亡;而線粒體Cl-通道可能與羅哌卡因誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降和細胞凋亡無關(guān)。
　　 第4章:羅哌卡因致SH-SY5Y細胞8-oxoG損傷及其修復(fù)機制研究
　　 目的:本研究擬以SH-SY5Y細胞作為研究對象，觀察SH-SY5Y細胞在局麻藥羅哌卡因處理后，細胞

30、凋亡與8-oxoG的產(chǎn)生的動態(tài)關(guān)系，以及8-oxoG和DNA修復(fù)酶激活的動態(tài)關(guān)系;以揭示8-oxoG是否是局麻藥羅哌卡因引起細胞DNA損傷的機制之一，DNA修復(fù)酶hOGG1，hMYH，和hMSH2酶的激活是否參與了局麻藥神經(jīng)損傷后的DNA修復(fù)。
　　 方法:SH-SY5Y細胞經(jīng)3mmol/l羅哌卡因處理4h，更換培養(yǎng)基后于0，3，6，12，24h時間點取樣，采用熒光抗體標(biāo)記8-oxoG，激光共聚焦顯微鏡檢測羅哌卡因處理前后各時間

31、點細胞內(nèi)8-oxoG水平;Westernblot檢測羅哌卡因處理前及處理后各時間點hOGG1，hMYH，和hMSH2酶的表達變化;流式細胞儀檢測各時間點的細胞凋亡率。
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-χ)±s)表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。不同時間點的8-oxoG水平，DNA修復(fù)酶的表達水平及細胞凋亡率采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett'sT3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)

32、意義。
　　 結(jié)果:8-oxoG水平與3種DNA修復(fù)酶的表達水平及凋亡率的變化趨勢均具有一致性，與加藥前的對照組比較，細胞經(jīng)羅哌卡因處理4h后，細胞內(nèi)8-oxoG水平明顯升高，于更換培養(yǎng)基后0h達到最高峰，隨后8-oxoG水平隨時間遞增逐漸下降;DNA修復(fù)酶hOGG1、hMYH及hMSH2在未經(jīng)羅哌卡因處理前僅有微量表達，經(jīng)羅哌卡因處理后，以上3種DNA修復(fù)酶表達均明顯升高，并于更換培養(yǎng)基后0h達到最高峰，隨后3種修復(fù)酶的水平隨