草魚基因組文庫(kù)構(gòu)建篩選及兩個(gè)核心MHCⅠ基因座序列圖譜研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、為研究草魚抗病基因的基因組結(jié)構(gòu),發(fā)掘草魚自身抗病基因和免疫相關(guān)基因,同時(shí)為了推進(jìn)比較基因組的研究。在本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)報(bào)道了26條草魚MHC Ⅰ(Ctid-MHC Ⅰ)cDNA序列,分析了多態(tài)性,并對(duì)Ctid-MHC Ⅰ基因組進(jìn)行了初步分析的工作基礎(chǔ)上,希望通過(guò)對(duì)Ctid-MHC Ⅰ基因組結(jié)構(gòu)的分析,闡明Ctid-MHC Ⅰ在基因組中的分布、數(shù)目及相互的關(guān)系,從而可以為Ctid-MHC Ⅰ的功能研究提供依據(jù)。 首先用已知cDNA序列的

2、草魚(fish C)的MHC Ⅰ的α3區(qū)做探針,對(duì)EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,HindⅢ,三種酶切的基因組進(jìn)行了Southern雜交。在獲得草魚MHC Ⅰ基因組信息的基礎(chǔ)上,借助fosmid文庫(kù)研究功能基因的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),我們將草魚(fish C)DNA,機(jī)械裂解后,經(jīng)末端補(bǔ)平,瓊脂糖凝膠電泳回收25-45kb的DNA片段,與同樣平末端的PcclFOS載體連接,經(jīng)λ噬菌體包裝轉(zhuǎn)染EP1300大腸桿菌后,鋪板,挑單菌落保存于96孔板,最終構(gòu)建

3、了草魚fosmid文庫(kù),命名為GCFL。為驗(yàn)證GCFL的庫(kù)容與質(zhì)量,用脈沖場(chǎng)電泳分析了50個(gè)經(jīng)Not Ⅰ酶切隨機(jī)挑選的克隆,并用3D-PCR技術(shù)對(duì)GCFL進(jìn)行了11個(gè)功能基因(MHC Ⅰ,MHC Ⅱα,MHC Ⅱβ,IFN-α,Mx,CD8α,IgMCH4,β2m,C3b,GH,β肌動(dòng)蛋白)的篩選。 然后挑選兩個(gè)含MHC Ⅰ的fosmid克隆命名為GCFL-0405E6、GCFL-07311G8,分別搖菌提取質(zhì)粒DNA后,超聲波

4、裂解,經(jīng)末端補(bǔ)平,瓊脂糖凝膠電泳回收2.3kb的DNA片段,與同樣平末端的pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌中,然后鋪板,建立亞克隆庫(kù)。隨機(jī)挑菌經(jīng)鑒定后測(cè)序。進(jìn)行序列拼接,最后獲得了兩個(gè)長(zhǎng)度分別為33kb和36.3kb的草魚基因組序列,并對(duì)其進(jìn)行了基因預(yù)測(cè)、啟動(dòng)子分析和同源性比較等一系列研究。 結(jié)果顯示:通過(guò)Southern雜交,MHC Ⅰα3區(qū)與三種酶切的基因組有4條帶,推斷草魚的2倍體基因組可能有2個(gè)基因座,4個(gè)等

5、位基因;同時(shí)我們成功構(gòu)建了草魚fosmid基因組文庫(kù),構(gòu)建的GCFL包含129,014克隆,單克隆保存于96孔板中,文庫(kù)含有1344塊96孔儲(chǔ)菌板,每12塊96孔板組成一個(gè)超級(jí)池,文庫(kù)一共由112個(gè)超級(jí)池構(gòu)成。通過(guò)脈沖場(chǎng)電泳分析經(jīng)Not Ⅰ酶切的fosmid克隆,顯示平均插入片段為35kb,通過(guò)計(jì)算GCFL覆蓋了4.1倍草魚基因組。用3D-PCR法篩選的11個(gè)功能基因,陽(yáng)性克隆個(gè)數(shù)為1-6,通過(guò)在斑馬魚的染色體定位顯示這些基因可能遍布于

6、草魚不同染色體上,證明從GCFL中可以篩到任何有用的功能基因。 在克隆GCFL-07311G8和GCFL-0405E6中,包含的完整的MHC Ⅰ基因,分別命名為:Citd-UAA和Citd-UBA。通過(guò)基因預(yù)測(cè)、啟動(dòng)子分析和同源性比較等分析認(rèn)為:Citd-UAA和Citd-UBA是經(jīng)典的MHC Ⅰ基因,都具有表達(dá)功能,兩者屬于草魚MHC Ⅰ基因的不同等位基因座,與Southern雜交結(jié)果,草魚可能有2個(gè)MHC Ⅰ等位基因座相符。

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