人腸上皮細胞泛素連接酶TRAF6泛素化修飾.pdf

1、沙門氏菌是一種革蘭氏陰性腸道桿菌，感染宿主動物后能夠引發(fā)多種疾病。沙門氏菌可以通過多種致病效應分子的作用在宿主體內定殖、存活、復制，其中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)在沙門氏菌致病過程中發(fā)揮極其重要的作用。該分泌系統(tǒng)能夠分泌60多種效應分子進入宿主細胞并發(fā)揮其調節(jié)宿主細胞生物學過程的功能。SopB是由沙門氏菌SPI-1Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的具有肌醇磷脂酶活性的效應蛋白。目前的研究發(fā)現(xiàn)，SopB在沙門氏菌感染宿主細胞的過程中，其時間和空間上的精確調控依賴于其

2、泛素化修飾?；诖?，通過體外活性重組技術，分離到了人腸上皮細胞泛素化修飾SopB的泛素連接酶TRAF6。
　　 為了進一步通過體內實驗確認TRAF6是能夠泛素化修飾沙門氏菌SopB的泛素連接酶，我們首先通過RNA干擾技術篩選到了TRAF6高效阻斷表達的Henle-407 shTRAF6細胞系。此外還利用TRAF6基因缺失的鼠胚成纖維細胞Traf6-/-做為研究模型，確認了TRAF6是人腸上皮細胞中泛素化修飾SopB的泛素連接酶。

3、基于SopB的泛素化修飾是能夠將SopB從細胞質膜定位至沙門氏菌內含小泡SCV的關鍵因素，進一步利用激光共聚焦技術比較了TRAF6對SopB亞細胞定位的影響，結果表明TRAF6的缺失導致SopB從沙門氏菌感染部位擴散，而不能與沙門氏菌共定位?；谏鲜鼋Y果，為了進一步研究SopB與TRAF6之間是否存在相互作用，我們利用免疫共沉淀技術分析發(fā)現(xiàn)SopB與TRAF6之間能夠共沉淀，進而表明兩者之間存在相互作用。TRAF6是細胞內重要的信號分子

4、，基于SopB被發(fā)現(xiàn)具有多種功能，包括能夠激活細胞MAPKs的磷酸化以及Akt的磷酸化等。因此我們進一步分析是否SopB的生物學功能的發(fā)揮依賴于TRAF6的活性。結果表明：TRAF6部分的介導了受SopB激活的原癌基因Akt的磷酸化。同時利用shTRAF6細胞系的研究發(fā)現(xiàn)TRAF6介導了受沙門氏菌感染以及LPS處理誘導的MAPKs的磷酸化激活。綜上所述，TRAF6泛素化修飾沙門氏菌效應分子SopB，并且與之形成復合物介導了受SopB激活