嗜水氣單胞菌J-1株OmpA蛋白原核表達、免疫原性分析及適于四膜蟲的OmpA表達載體構建.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是人和多種動物的病原菌，其外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)具有良好的免疫原性。 1．根據已發(fā)表的嗜水氣單胞菌外膜蛋白A(OmpA)基因序列設計一對引物，PCR檢測18株嗜水氣單胞菌ompA分布情況，然后將J-1株、Y-65株&SPS-104株的ompA基因進行克隆測序。PCR檢測結果表明15株擴增出目的片段。測序分析發(fā)現(xiàn)，34克隆的基

2、因片段均為948bp，編碼316個氨基酸。與NCBI上登錄的序列相比，同源性在93.1％-95％之間，缺失4個氨基酸。其中J-1株和SPS-104株的ompA基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為99.2％和98.1％，氨基酸缺失的位置一致；AhJ-1株和Y-65株ompA基因的核苷酸和氨基酸序列88.7％和89.6％，氨基酸缺失的位置相似。用DNA Star Protean進行的抗原性和表面結構域預測表明，與5株國內外氣單胞菌參考株的抗

3、原性比較，抗原位點分布基本一致，說明OmpA蛋白很可能為氣單胞菌屬共有的保護性抗原。 2．將擴增得到的去除信號肽序列J-1株的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段，定向克隆至表達質粒pET32a(+)中，重組質粒經限制性酶切鑒定后測序。結果表明插入片段長度為948bp，與NCBI上登錄的序列相比，同源性為93.1％～95％，缺失4個氨基酸。將重組原核表達質粒pET32a-ompA轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，經誘導可表達分子量約

4、57.4kD的蛋白，凝膠薄層掃描顯示OmpA在轉化菌中表達量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株總外膜蛋白的血清進行Western blot，在57.4kD處有明顯反應條帶。融合蛋白經Ni-NTA親和層析純化后免疫新西蘭兔制備抗血清，ELISA效價達1:12800以上。Western blot檢測結果顯示，該血清與9株具有代表性的氣單胞菌的約35kOq外膜蛋白均有較強反應，說明所表達的融合蛋白不僅保持原有外膜蛋白的免疫原性，而且提示O

5、mpA可能是嗜水氣單胞菌的共同保護性抗原。 3．為了能在一個啟動子的控制之下，既表達抗性篩選標記，又能表達表位抗原OmpA蛋白，本試驗自行設計兩對引物，應用重組PCR技術，先分別以pSK-H4-I-neo和嗜水氣單胞菌J-1株為模板，獲得抗性基因neo和外膜蛋白基因ompA，再通過重疊延伸的方法，將兩個基因通過一疏水性柔性多肽接頭(Gly<,4>Ser)<,3>堿基序列進行前后拼接，構建neo-GS-ompA融合基因。并以此融

6、合基因取代pSK-H4-I-neo質粒中的neo基因，從而構建一個擬在四膜蟲體內表達外膜蛋白OmpA的表達質粒pSK-H4-I-neo-GS-ompA。序列分析表明neo、ompA及l(fā)inker拼接組合的順序、方向及序列完全正確。質粒的正確構建為下一步轉化四膜蟲奠定基礎。 4．本試驗首先摸索了四膜蟲最佳電擊時間，然后將適于四膜蟲的基因表達載體pSK-H4-I-neo-GS-ompA及其酶切后獲得的整個編碼區(qū)的線性插入片斷，在不同

7、的緩沖液、電壓及電容的組合下，電擊轉化到嗜熱四膜蟲接合株體內進行同源重組，以期在蟲體內同時表達抗性基因neo和抗原基因ompA。結果：將四膜蟲BF-1和BF-5分別在37℃靜置饑餓22h時后混合，混合6h后開始接合，混合后7-8h接合對數達到高峰，此時為電擊轉化的最佳時間；接合期的蟲株比正常狀態(tài)的要小一些。pSK-H4-I-neo-GS-ompA及插入片斷電擊后均未獲得抗性蟲株，抗性基因neo未得到表達，可能是ompA基因中含有較多四膜