S5a結(jié)合死亡受體6,通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1的分化.pdf

1、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，因其良好的治療效果和相對(duì)較弱的不良反應(yīng)，是近年來(lái)針對(duì)腫瘤治療，尤其白血病治療的研究熱點(diǎn)。已有的研究證明，angiocidin，利用來(lái)源于血小板凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)多肽CSVTCG-瓊脂糖親和層析柱從肺癌細(xì)胞中分離得到了一種蛋白質(zhì)，具有誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞，一種經(jīng)典的單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，分化為成熟的巨噬細(xì)胞的作用。而這些作用可以通過(guò)MAPK、NF-κB和PI3K三條信號(hào)通路介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。S5a，胞內(nèi)26S蛋白酶體

2、亞單位，在蛋白質(zhì)序列上和angiocidin基本一致。本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)已證明，S5a可以誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，并且在能夠在THP-1細(xì)胞膜上與死亡受體6(Death Receptor6)結(jié)合。但是其結(jié)合活性，結(jié)合方式，以及這種結(jié)合在S5a誘導(dǎo)分化的過(guò)程中是否起作用，如何作用，都還未知。本論文將從以下兩個(gè)部分，闡述死亡受體6(DR6)在S5a的作用下，介導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　 第一部分 S5a和DR6的結(jié)

3、合活性分析。
　　 首先，為了驗(yàn)證DR6在介導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，我們給予DR6干擾RNA，或者可溶性DR6受體，通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志和細(xì)胞吞噬能力的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的能力明顯減弱。這就證明了DR6在S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中，發(fā)揮了重要的作用。隨后，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，證明了DR6和S5a是在高親和力的作用下結(jié)合的，EC50=145±13nM。同時(shí)，我們還通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析了DR6和S

4、5a的相互結(jié)合，并得到了兩種最可能的結(jié)合方式，以及幾個(gè)可能的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點(diǎn)。
　　 第二部分 S5a通過(guò)DR6誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的機(jī)制研究。
　　 在前期的研究中，檢測(cè)到了NF-κB信號(hào)通路經(jīng)典途徑中的蛋白磷酸化P65，在S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)量升高。為了進(jìn)一步深入研究NF-κB信號(hào)通路在S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，我們檢測(cè)了NF-κB非經(jīng)典通路中的蛋白P52的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了下調(diào)

5、膜受體DR6后P-P65和P52的表達(dá)。為了研究NF-κB信號(hào)通路經(jīng)典和非經(jīng)典途徑在S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，我們使用了NF-κB抑制劑分別抑制了NF-1κB經(jīng)典和非經(jīng)典途徑，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能學(xué)觀察了S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的情況。由此我們得到了NF-κB信號(hào)通路的激活在S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的過(guò)程中起到了重要的作用的結(jié)論。此外，我們還觀察了在S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中，在血液系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作

6、用的轉(zhuǎn)錄因子c-myb的變化。在給予THP-1 S5a誘導(dǎo)后，c-myb的mRNA水平明顯下調(diào)，而DR6 siRNA干擾可以抑制c-myb的下調(diào)。這些結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄因子c-myb也在S5a誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用。
　　 本課題在實(shí)驗(yàn)室前期的研究基礎(chǔ)上，確認(rèn)了死亡受體6(DR6)可以和S5a功能性結(jié)合，并且介導(dǎo)了THP-1細(xì)胞的分化。定義了S5a為DR6的新配體。通過(guò)深入研究S5a誘導(dǎo)單核白血病細(xì)胞THP-1分化